狗尾草胚性愈伤高效农杆菌转化体系的建立

赵辉　郭静远　孔华　郭安平

摘 要 狗尾草是研究C4光合作用的优秀模型，具有热带植物的典型特征，也可作为研究热带作物的重要模型，高效的转基因技术是模式植物广泛服务于科研的基础，目前狗尾草作为模式植物的研究在国外越来越热门，但在国内还没有被关注。但作为模式植物狗尾草现有的转化技术还不完善，转化周期有待缩短，转化效率需要进一步提高。本研究以狗尾草ME34品系不同阶段胚性愈伤为外植体进行农杆菌转化体系研究，通过实验大大提高了狗尾草的转化效率，缩短了转化周期，为狗尾草转基因研究提供了新的技术方法，新方法主要包括以下技术环节：高效胚性愈伤诱导技术，受体胚性愈伤的选择，适宜转化的农杆菌株系及培养条件，浸染和共培养条件与方法，抗性愈伤筛选条件，抗性愈伤成苗条件等。

关键词 狗尾草；遗传转化；农杆菌介导法

中图分类号 S544.3 文献标识码 A

Abstract Setaria viridis is a wild-type species of Setaria italica and is an excellent model for studying the photosynthesis of C4. It is also a model for studying monocotyledonous plants， abiotic stress tolerance and energy plants. At present， the research of S. viridis is becoming more and more popular abroad， but the understanding of this model is still at the initial stage in domestic. In this study， the high efficient embryogenic callus induction technique was established， and the Agrobacterium transformation system of embryogenic callus was studied by using ME34 different stages of embryogenic calli. Which provided a new high efficient Agrobacterium transformation system for Setaria viridis： Light culture of seeds at early stage promoted embryogenic callus induction； Embryogenic calli with less than 3 subcultures was chosen for transformation； AGL 1 strain was used to transform and cultured at 20 ℃； The macro-elements of inoculation and cocultivation medium was halved and pH adjusted to 5.2； AGL 1 was activated 2-3 hours before inoculation； Inoculation with 30～60 minutes； Co-cultured with 5-7 days； Embryogenic calli selection with 40-50 mg/L hygromycin for at least 1 month； In the late period of calli selection， light culture promoted regeneration； At the regeneration and rooting stage， the selection was 20 mg/L hygromycin； Seedlings with root hair were the positive plants.

Key words Setaria viridis； genetic transformation； agrobacterium transformation

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.06.020

狗尾草（Setaria viridis）屬单子叶植物纲禾本科黍亚科，黍亚科常分布在热带和亚热带地区，高粱、甘蔗、玉米、谷子、薏苡、黄茅、白茅等都属于黍亚科，该科植物具有热带植物的典型特征。狗尾草是谷子（Setaria italica）的野生近缘种，是研究C4光合作用的优秀模型，同时也是研究单子叶植物、非生物胁迫耐受性和能源植物的模型，目前狗尾草作为模式植物在国外的研究越来越热门，国内对该模式植物的认识还处于起步阶段，研究较少。此外，狗尾草是新型的转基因模式植物，与双子叶模式植物拟南芥相比具有生长周期短、植株矮小、易于种植、容易转化、基因组小、二倍体、能产生大量自交系种子等优点，是优良的单子叶模式植物；由于其起源于热带，具有C4光合作用系统，与谷子、玉米、高粱、甘蔗、薏苡以及重要能源草类亲缘关系接近，是重要的C4植物模型；狗尾草是谷子（Setaria italica）的野缘近亲，两者核型基本相同，带型相近，基因组大小都约为510 Mb，是研究谷子基因的重要模型，亦是研究人工选择对作物进化影响的模式植物；狗尾草对非生物胁迫耐受能力强，抗性基因丰富，是研究耐旱、耐热、耐盐等胁迫反应的重要模式植物；狗尾草与重要的能源作物柳枝稷、芒草等黍亚科草类形态学上非常相似，是研究这些能源草类的重要模式植物[1-10]。

高效的转基因技术是模式植物广泛服务于科研的基础，目前狗尾草的研究在国外越来越热门，已有遗传转化体系的研究报道，但作为模式植物，其转化周期和转化效率有待进一步优化提高。本研究参考最早开启狗尾草模式植物研究的美国Donald Danforth Plant Science Center 的Thomas P. Brutnell实验室[1]和美国康奈尔大学Joyce Van Eck实验室[2]的转化方法，建立和优化狗尾草胚性愈伤高效农杆菌转化体系，为狗尾草作为模式植物研究提供新的技术方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料及转化受体材料 以狗尾草ME34品系为植物材料，材料由美国Donald Danforth Plant Science Center的Thomas P. Brutnell实验室提供。以ME34品系经休眠处理的成熟种子去皮发芽后诱导的胚性愈伤为转化外植体材料。

1.1.2 农杆菌及质粒 农杆菌为AGL 1菌株，转化质粒为pZmUbi-GUS（ZmUbis-HPH）见图1，GUS标记基因，HygR植物筛选基因，KanR菌落筛选基因，由美国Donald Danforth Plant Science Center的Thomas P. Brutnell 实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 相關组培技术

（1）种子的无菌处理和胚性愈伤诱导。选取经休眠处理的狗尾草干燥成熟种子，去除种皮后将约1 g种子装入14 mL离心管，用10 mL有效浓度约1%～3%的次氯酸钠溶液加50 μL吐温20溶液，灭菌消毒处理约10 min，无菌水清洗多次后，将种子接种于胚性愈伤诱导培养基（CIM）上。CIM是以改良MS培养基为基础培养基，添加微量元素35 mg/L ZnSO4·7H2O，0.6 mg/L CuSO4·5H2O，激素2.0 mg/L 2，4-D，0.5 mg/L KT，4 g Gelzan植物凝胶，pH调整到5.8。接种种子时注意种子芽点朝上，不直接接触培养基，每皿培养基接种子约25个。培养温度24 ℃，暗培养或光培养（弱光，12 h/12 h，day/night；50%～60%湿度）；观察胚性愈伤诱导情况。

（2）胚性愈伤继代培养。挑取种子诱导出的胚性愈伤在CIM上进行继代培养，每2周继代1次，观察愈伤增殖和再生情况。培养温度24 ℃，暗培养。

1.2.2 农杆菌介导胚性愈伤转化

（1）转化用农杆菌的准备。转化前3～5 d将带pZmUbi-GUS（ZmUbis-HPH）质粒的AGL 1菌株在添加50 mg/L Carbenicillin和50 mg/L Kanamycin 的LB培养基上涂板，最好挑取2个以上单菌落同时涂板，20 ℃暗培养。

（2）农杆菌的活化处理及浸染。挑取培养3～5 d的新鲜农杆菌菌块，用浸染培养基（CIML）悬浮处理，菌液浓度调整到OD600 0.6～0.8，然后20 ℃轻摇振荡培养2～3 h，以活化农杆菌。然后将胚性愈伤加入活化的浸染液中，一般每50 mL菌液中加入50～100块胚性愈伤（直径约0.5 cm），20 ℃轻摇振荡浸染0.5～1 h。CIML是液体培养基不添加植物凝胶，以改良MS培养基为基础的培养基，添加激素 2.0 mg/L 2，4-D，0.5 mg/L KT，添加乙酰丁香酮（acetosyringone）40 mg/L，添加表面活性剂Synperonic 0.1%（质量体积比）；配制两种浸染液，其中CIML1的MS大量元素减半，pH调整到5.2，CIML2的参照文献[1-2]，MS大量元素不减半，pH调整到5.8。

（3）胚性愈伤与农杆菌共培养。将经过浸染过程的胚性愈伤从浸染液中取出，用无菌滤纸吸干多余的菌液，然后将愈伤接到放有滤纸的共培养培养基上（CIMC），20 ℃ 暗培养3～9 d，分别在共培养3、5、7、9 d时取出愈伤，用GUS瞬时表达染色，观察不同浸染和共培养条件的转化效果。CIMC是固体培养基添加4 g Gelzan植物凝胶，以改良MS培养基为基础培养基，添加激素2.0 mg/L 2，4-D，0.5 mg/L KT，添加乙酰丁香酮（acetosyringone）40 mg/L；配制两种共培养基，其中CIMC1的MS大量元素减半，pH调整到5.2，CIMC2的参照文献[1-2]，MS大量元素不减半，pH调整到5.8。

（4）抑菌和筛选培养。将经过共培养的愈伤接到抑菌和筛选培养基（CIMS）上进行抑菌和筛选培养，观察农杆菌抑制情况，农杆菌不污染的条件下，每2周继代1次，24 ℃暗培养或后期配合光培养，观察抗性愈伤生长情况，选择合适的筛选浓度和筛选培养时间。CIMS是在CIM的基础上添加抑制农杆菌的抗生素Timentin 200 mg/L，添加筛选剂Hygromycin 40或50 mg/L。

（5）抗性愈伤成苗培养。将抗性愈伤或抗性幼芽接到成苗培养基（PRM），24 ℃光培养。PRM是以改良MS培养基为基础培养基，蔗糖20 g/L，pH值为5.8，添加激素2 mg/L KT，添加Timentin 100 mg/L，添加Hygromycin 20 mg/L，培养时间2～4周。

（6）生根培养。将在PRM上再生达到约1 cm以上的芽单独取出，接到生根培养基（RM）上生根，24 ℃光培养。RM是以改良MS培养基为基础培养基，其中大量元素减半，蔗糖减半，pH值为5.8，添加Timentin 100 mg/L，添加Hygromycin 20 mg/L，培养时间1～2周。

1.2.3 调查项目及统计方法 针对种子诱导胚性愈伤的数量，进行胚性愈伤诱导率统计，胚性愈伤诱导率=诱导出胚性愈伤的种子数/发芽种子数×100%；针对不同共培养时间，不同浸染和共培养条件，进行GUS基因瞬时表达染色观察；经筛选抑菌过程后，进行抗性愈伤块的数量统计，抗性愈伤诱导率=抗性愈伤块数/转化的胚性愈伤块数×100%，胚性愈伤转化率=再生抗性植株的愈伤块数/转化的胚性愈伤块数，抗性苗阳性率=GUS染色阳性苗数/抗性苗总数×100%。

1.2.4 GUS检测 GUS染色液按照常规方法配制X-Gluc母液和X-Gluc基液，然后按比例混合后储存于4 ℃冰箱备用，取用于检测的组织块，加入GUS染色液中37 ℃过夜染色，倒掉染色液，70%的酒精脱色1～3次，95%的酒精脱色1～2次，观察GUS染色情况。

2 结果与分析

2.1 光暗培养对胚性愈伤诱导效率的影响

胚性愈伤诱导率低，以及缺少胚性愈伤的挑取经验是限制狗尾草种子胚性愈伤转化体系广泛应用的主要因素。除调整部分培养基配方外，在同样的CIM培养基上，参照文献[1-2]的方法在24 ℃暗培养条件下诱导出的愈伤（图2-A），胚性愈伤诱导率低于10%，因此需要多次继代增殖以产生足够的胚性愈伤进行转化。

经观察愈伤诱导过程中的生长情况，发现胚性愈伤诱导率低的缘故主要在于诱导过程中非胚性的愈伤比胚性的愈伤生长快，很快就占领了胚性愈伤的生长空间；进一步观察发现胚性愈伤都从种子发芽后的生长点处长出来，而非胚性的愈伤是从发芽后的叶子和根处长出。为了提高种子的胚性愈伤诱导率，将胚性愈伤诱导过程移至光培养状态下，实验表明由于光照下叶子变绿，变绿的叶子对培养基的激素耐受力提高，难诱导出愈伤，而生长点部位的愈伤诱导不受影响，这样就大大提高了胚性愈伤的诱导效率。进一步实验观察，如果胚性愈伤诱导一直在光下进行，诱导出的胚性愈伤会很快老化再生成芽，不利于胚性愈伤的继代增殖和基因转化的后续实验。

因此，综合以上实验与观察，在种子诱导胚性愈伤初期，即接种子后在光照下培养一周后移到暗培养条件，能大大提高种子胚性愈伤的诱导率（见图2-B），ME34品系胚性愈伤诱导率达43%，A10品系胚性愈伤诱导率达50%，同时诱导出的胚性愈伤不易老化，不影响胚性愈伤继代增殖能力。

2.2 浸染和共培养条件对转化效率的影响

根据玉米、水稻、大豆等作物高效农杆菌转化经验，参见文献[1-2]的方法，实验为狗尾草转化设计了两套不同的浸染和共培养条件，OLD方法与文献[1-2]的一致，采用CIML2和CIMC2培养基，NEW方法改变了浸染培养基和共培养培养基的成分与pH，即MS大量元素减半，pH调整到5.2，采用CIML1和CIMC1培养基。共培养温度为20 ℃。从图3农杆菌转化共培養不同时间的GUS染色情况可知，NEW方法GUS染色整体情况比OLD方法强：共培养3 d时差异不大，仅在愈伤表面染色；共培养5 d时GUS染色差异明显，NEW方法明显染色面积更大，染色深入到胚性愈伤块内部，而OLD方法GUS染色面积小，主要是愈伤块表面染色；共培养7 d时，两种方法染色面积相当，但NEW方法染色更深入胚性愈伤内部。共培养阶段GUS染色情况反映的是被转化基因进入受体细胞的瞬时表达情况，强的瞬时表达意味着更高的转化效率。此外，从瞬时表达情况看，共培养3 d时农杆菌只进入了愈伤表面少量的胚性受体细胞，得到染色的主要是愈伤块表面不容易再生植株的非胚性愈伤；共培养5 d以上才有足够量的胚性愈伤细胞受到农杆菌感染得到转化，因此狗尾草胚性愈伤转化时共培养时间至少5 d以上才有高的转化效率。

从表1统计结果可见，在其他条件一致，浸染和共培养阶段大量元素含量和pH条件的改变对狗尾草胚性愈伤农杆菌转化效率的影响是显著的，OLD和NEW的条件相比，抗性愈伤率从51%升高到100%，胚性愈伤转化率从42%提高到80%，转化效率成倍提高。

2.3 胚性愈伤继代时间对转化效率的影响

在转化实验中发现，狗尾草胚性愈伤不耐继代，随着继代次数的增加，胚性愈伤容易老化、分化，转化效率明显降低。从图4可见，分别挑选继代1次和4次的胚性愈伤在相同转化条件下同时进行转化，胚性愈伤经过Hygromycin 50 mg/L 1个月筛选抗性愈伤再生情况差异显著，早期的胚性愈伤有很多抗性愈伤再生，说明转化效率很高；继代4次的胚性愈伤抗性愈伤再生能力很差，说明转化效率很低。从实验结果可知，胚性愈伤的状态和继代时间显著影响狗尾草农杆菌转化效率。

2.4 筛选条件对转化效率的影响

参照文献[1-2]的方法对转化的胚性愈伤进行了筛选，实验中发现，当用40 mg/L Hygromycin筛选半月后转接到成苗培养基上很难得到真正的转化苗，假阳性很高。实验中进一步观察发现，当转化后的胚性愈伤在40 mg/L Hygromycin CIMS上培养半月时，大部分转化愈伤还没有褐化，新鲜的抗性愈伤还没有大量再生。高效的胚性愈伤转化，在筛选阶段一般先伴随着旧愈伤的大量褐化死亡，之后是新的抗性愈伤的再生和增殖。由于在参考文献中未看到明显此种现象，实验中调整了筛选条件，在抗性愈伤诱导阶段（CIMS），以及成苗（PRM）和生根（RM）阶段都增强了筛选力度，实验及统计结果见表2。从表2可知ME34狗尾草品系胚性愈伤适应较高的筛选浓度，愈伤筛选阶段40～50 mg/L Hygromycin的浓度下至少筛选1个月（2周继代一次）才有足量的抗性愈伤再生，此外愈伤筛选阶段Hygromycin的筛选浓度不同会影响抗性苗阳性率，在40 mg/L Hygromycin的条件下抗性苗阳性率为42%，每块愈伤再生的抗性苗数多，在50 mg/L Hygromycin的条件下抗性苗阳性率为95%，每块愈伤再生的抗性苗数明显减少（GUS染色情况见图5）。实验结果表明，更高的筛选条件抗性苗的阳性率增加，但抗性苗出苗数减少，转化过程中需要观察愈伤生长状况调整筛选条件，才能结合不同的狗尾草品系，不同继代次数的胚性愈伤受体材料情况，达到高效的筛选和再生。

2.5 光照条件对转化效率的影响

在转化实验中发现随着胚性愈伤筛选时间的加长，转化周期随之延长，为了缩短转化周期，在胚性愈伤筛选阶段后半月将进行筛选的愈伤移到弱光下培养，这样的改变达到了很好的转化和成苗效果，一方面抗性愈伤继续再生增殖，另一方面较早再生的抗性愈伤在光照的影响下开始分化，缩短了转化苗后继再生的时间，提高了转化苗的再生效率，狗尾草转化效率成倍提高（见图6）。

2.6 优化后的狗尾草ME34品系胚性愈伤农杆菌转化体系及时间表

综合以上实验，狗尾草ME34品系胚性愈伤农杆菌高效转化体系基本过程如下（图7）：胚性愈伤诱导需要4周，种子接到愈伤诱导培养基上的第1周光培养，之后暗培养；诱导出的胚性愈伤直接用于转化或继代1～2次后再转化，第1次胚性愈伤继代2周时间，第2次1周时间，都有较高的转化效率，胚性愈伤继代3次后转化效率明显降低；胚性愈伤浸染后共培养5～7 d；接着进行抑菌和筛选，筛选在高浓度筛选条件（40～50 mg/L Hygromycin）下4周，每2周继代1次，愈伤筛选后期转到光下培养；成苗培养（低筛选浓度20 mg/L Hygromycin）1周；生根培养1周（低筛选浓度20 mg/L Hygromycin）。

3 讨论

狗尾草除作为模式植物外，其转化体系本身也是很好的研究转化技术的模式，其胚性愈伤诱导周期短，且能继代增殖，通过改变胚性组织诱导条件，能很好的验证外界条件对体胚组织诱导、发育、分化等的影响。通过实验证明改变浸染和共培养条件能显著提高狗尾草胚性愈伤转化效率，无论瞬时表达效率还是稳定表达效率都明显提高，因此浸染和共培养条件是狗尾草农杆菌转化的重要技术环节；此外，愈伤的状态（继代次数）也是影响转化的关键因素，继代3次以上的胚性愈伤，不建议用作受体材料；同时，光暗培养条件能显著影响狗尾草胚性愈伤诱导效率和抗性愈伤再生成苗效率，这可能跟狗尾草的热带起源有关，配合适宜的光暗培养条件是提高狗尾草胚性愈伤整体转化效率的重要环节。根据实验优化的转化体系，整个转化周期11～14周，比国外文献[1-2]4个月（16～17周）缩短了1个多月时间，转化效率也成倍提高，由A10品系5%的转化效率[2]，提高到ME34品系约43%×22×83%×95%=135.6%的转化效率，国内还没有狗尾草高效转化体系的报道。

实验中发现狗尾草的转化效率还跟品系有关系，ME34是比较适宜转化的品系，原因主要是该品系的胚性愈伤容易诱导，并且耐受继代增殖，抗性愈伤再生成苗的能力也较强；与之相比A10品系虽然胚性愈伤更容易诱导，但該品系的胚性愈伤不耐受继代过程，容易老化，对筛选剂敏感，抗性愈伤再生成苗的能力弱，因此需要根据不同品系的特点适当的调整转化中的各项技术指标，才能达到高的转化效率。ME34和A10品系都是国外研究较多的狗尾草品系，网上已经有它们的基因组数据信息公开，便于转化前后的基因研究与比对。

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