番木瓜籽蛋白提取工艺及其性质研究

马若影　李幼梅　白新鹏　武林贺　张宇翔　王锡兰

摘 要 为开发利用番木瓜籽中的蛋白质，以番木瓜籽蛋白提取率为指标，通过单因素实验比较超声辅助提取（UAE）与超声-微波协同辅助提取（UMAE）对番木瓜籽蛋白提取的影响，并确定辅助提取方法及条件，后采用Box-Behnken试验设计优化提取工艺，并对番木瓜籽蛋白等电点、溶解性、起泡性、乳化性、持水性等性质进行研究。结果显示：UMAE较UAE提取番木瓜籽蛋白具有更快速、高效、节能的特点；响应面优化UMAE提取工艺条件为料液比1 ∶ 90，提取2 min，功率50 W，提取率约为52.31%，与理论值无显著差异；番木瓜籽蛋白的等电点pI4.56，pH4.5时起泡性最好，乳化性、溶解度最低；該蛋白持水能力较低，为（1.58±0.3）g/g。

关键字 番木瓜籽蛋白；提取；响应面；性质

中图分类号 S667.9 文献标识码 A

Abstract The effect of solid-liquid ratio， extraction time and power of machine on the yield of protein in papaya seed was studied. The extraction method and conditions of papaya seed protein were confirmed by the single factor experiments of UAE and UMAE and the optimal process was determined by the Box-Behnken design. The properties of papaya seed protein such as isoelectric point（pI）， solubility， foamability， emulsibility and water binding capacity were explored. Results indicated that UMAE was superior to UAE of papaya seed protein which was extracted rapidly and efficiently relatively. The optimal extract process was that solid-liquid ratio was 1 ∶ 90， extracted for 2 min， power was 50 W of the machine. Under this condition， the extract yield of papaya seed protein was about 52.31%. The pI of the extracted protein in papaya seed was 4.56. At pH4.5，the foaming ability was the highest which was opposite to the ability of emulsification and solubility. The protein extracted from papaya seed was short of water-holding which was（1.58±0.3）g/g.

Key words Papaya seed protein； extraction； response surface； properties

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.06.022

番木瓜（Carica Papaya L.）属十字花目番木瓜科[1]，据FAO统计[2]，全球番木瓜年产量超1 000万t。番木瓜籽呈卵球形，无外壳，外层由半透明的果胶包裹，内籽表明凹凸不平，呈黑棕色，约占番木瓜质量的7%，是番木瓜加工后的下脚料。目前，有关番木瓜籽的研究，主要集中在番木瓜籽油提取[5]、脂肪酸鉴定及活性成分提取等[3-4]方面，鲜见其蛋白质相关方面的研究报道，邓楚津[6]通过分析番木瓜籽的基本营养成分，发现番木瓜籽粗蛋白约为24.91%，其必需氨基酸种类齐全，且赖氨酸、络氨酸、苯丙氨酸等必需氨基酸含量丰富，可与谷物搭配起蛋白质互补作用。

查阅国内外文献，有关番木瓜籽蛋白的提取工艺、性质等方面研究甚少。据此，本试验比较超声辅助和超声微波提取番木瓜籽蛋白，并采用响应面优化提取工艺，对番木瓜籽蛋白的等电点、溶解性、起泡性、乳化性、持水性等性质进行研究，旨在为进一步综合利用番木瓜籽蛋白提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

仪器与设备见表1。

番木瓜籽及前处理：产自海南大学农学院植物园，属番木瓜属番木瓜种红肉番木瓜，编号HNsp5018。用自来水冲洗番木瓜籽，去除杂物，洗至干净，晾干，置于冻干机中-80 ℃，5 MPa冷冻干燥，粉碎机粉碎，过80目筛，取筛下物用石油醚1 ∶ 30（w ∶ v）反复脱脂至脂类成分脱除干净，干燥，即为试验原料。

试剂：牛血清蛋白标品、考马斯亮蓝G-250、95%乙醇、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氢氧化钠、盐酸、十二烷基磺酸钠（SDS）等，购自广州市化学试剂厂，均为AR。

1.2 试验方法

1.2.1 番木瓜籽蛋白质提取 蛋白质提取率计算：原料粗蛋白采用凯氏定氮法[7]测定，参照国标GB 5009.5-2010[8]《食品中蛋白质的测定》，考马斯亮蓝法[9]测定番木瓜籽提取液中蛋白质含量，蛋白质提取率公式按下式计算：

番木瓜籽蛋白提取率Y/%=提取液中蛋白质含量/原料蛋白质含量×100

蛋白质标准曲线建立：取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1 mL浓度为100 μg/mL的蛋白质溶液，采用蒸馏水补足至1 mL，加入2.0 mg/mL考马斯亮蓝G-250，混匀反应2 min后在620 nm进行测定，以蛋白质浓度为横坐标、吸光度Abs为纵坐标作标准曲线，线性回归方程为y=0.007 1x+0.079 8，R2=0.998 3。

提取工艺流程：取番木瓜籽粉，加磷酸盐缓冲液（PBS）（pH8.0），用辅助手段提取后离心分离，先上清液等电点沉淀，再水洗沉淀，最后冷冻干燥即成番木瓜籽蛋白。

提取工艺优化：试验分2个阶段进行，先通过单因素试验从料液比、时间、功率比较UAE和UMAE对番木瓜籽蛋白质提取率的影响，确定辅助方法，采用Box-Behnken的中心组合实验设计原理对提取率高的方法进行试优化试验，整个实验过程控制提取液的温度在55 ℃以下。

1.2.2 番木瓜籽蛋白质性质研究 等电点：参考刘永创[10]等的方法，采用HAc-NaAc缓冲体系調节浸提液的pH3.0至7.0，8 000 r/min离心15 min，取上清液进行考马斯亮蓝染色，在620 nm处测吸光值。根据吸光值大小判定蛋白质等电点，等电点处蛋白质沉淀量最大，上清液蛋白含量最低，染色后吸光值最小。

溶解性：采用氮溶解指数（NSI）[11]评价番木瓜籽蛋白质溶解性[12]。用去离子水配制1%（W/V）番木瓜籽蛋白样品溶液20 mL，用0.5 mol/L HCl、0.5 mol/L NaOH溶液调节pH至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，磁力搅拌2 h，8 000 r/min离心15 min，采用微量凯氏定氮法测定上清液中的氮含量。重复3次，取平均值。

氮溶解指数NSI/%=上清液的氮含量/样品氮含量×100

起泡性：参考椰子分离蛋白起泡性[13]的测定方法并进行改进，取25 mL 1%的样品溶液，用0.5 mol/L HCl、0.5 mol/L NaOH溶液调节pH至4.0、5.5、7.0，室温条件下，用高速均浆机均质1 min，快速将样品转移到25 mL量筒中，测定样品总体积（V2），30 min后再次测量1次泡沫体积（V1）。重复3次，取平均值。

起泡性=（V2-V1）/V0，其中，V0为起始体积，V0=25 mL

乳化性：参考β-伴大豆球蛋乳化性[14]的测定方法并进行改进，0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.5）配制1%蛋白样品，用0.5 mol/L HCl、0.5 mol/L NaOH溶液调节pH至3.0、4.5、6.0、7.5，取1 mL色拉油与3 mL待测溶液于均质机中均质5 min，吸取搅打后的溶液，用0.1%十二烷基磺酸钠（SDS）稀释2 000倍，混匀后在500 nm处测定吸光值，以SDS溶液作为空白。重复3次，取平均值。

乳化活性指数（EAI）=（2.303×2×A500×稀释倍数）/（C×Φ×L）

式中：EAl为每克蛋白质的乳化面积，m2/g；Φ为油相所占的分数，在本实验中油相占1/4；C为蛋白质的浓度，1%；L为比色池光径，10 mm。

持水性：参照花生蛋白持水性[15]的测定方法并进行改进，取1.0 g样品置于20 mL离心管中，加入10 mL去离子水，室温下静置2 h后离心（5 000 r/min，20 min），将上清液倒去，并将离心管倒置在滤纸上，10 min后称量。持水力以每克样品吸附水的质量数表示。重复3次，取平均值。

2 结果与分析

2.1 超声、超声-微波辅助提取单因素实验

2.1.1 料液比对番木瓜籽蛋白提取率影响 将料液比作为变量，在其他条件相同下探讨UAE和UMAE这2种提取方法对番木瓜籽蛋白提取率的影响。由图1可知，随着料液比的增大，UAE和UMAE的提取率有明显的提高，后趋于平稳。当加入溶剂的量过少时，番木瓜籽粉末颗粒本身会吸收一定量的水分，导致作为辅助提取的介质液体减少，使得超声波及超声-微波在液相中的吸收大于在固相中的吸收。随着溶剂量的增加，加快了整个传质过程，提取率明显提高。在UAE中，当料液比大于1 ∶ 70时，提取率增加的幅度不大，趋于稳定；UMAE中料液比大于1 ∶ 90出现提取率饱和现象。从图1还可看出，UMAE番木瓜籽蛋白提取率明显优于UAE，料液比1 ∶ 90时，UMAE番木瓜籽蛋白提取率为45.65%，而UAE仅为25.33%，是UAE的1.8倍。UMAE较UAE具有微波作用，说明UMAE中的微波作用有助于番木瓜籽蛋白的溶出。

2.1.2 功率对番木瓜籽蛋白提取率影响 UAE与UMAE中功率对番木瓜籽蛋白提取率影响如图2所示，提取率由10 W时的22.43%、41.62%提高至50 W时的30.94%、47.7%。当功率大于50 W后，番木瓜籽蛋白UAE的提取率约为31.45%，UMAE约为48.24%，功率提高，提取率增大不明显。

2.1.3 时间对番木瓜籽蛋白提取率影响 UAE和UMAE方法中，时间对番木瓜籽蛋白提取率影响如图3所示，随处理时间的延长，蛋白质提取率随之增大，随后趋于稳定。UAE中反应10 min的番木瓜籽蛋白提取率为23.82%，UMAE中反应1 min的提取率为38.54%，是UAE的1.62倍。当UAE提取时间到达110 min后，番木瓜籽蛋白的提取率趋于饱和，约为38%；而UMAE反应2 min后，提取率保持在48%左右，是UAE提取时间达到110 min时的1.26倍。番木瓜籽蛋白在UAME中提取1 min的提取率与在UAE中提取110 min相当，由此可见，UAME较UAE在番木瓜籽蛋白提取中具有快速完成提取的特点。

2.2 响应面优化结果

综合1阶段从液料比、提取时间、提取功率比较UAE和UMAE对番木瓜籽蛋白提取率影响，选取蛋白质提取率高的UMAE采用Box-Behnken试验进行工艺优化，结果如表2所示。

采用Design-Expert V8.0.6进行多元回归拟合，得到回归模型方程：

Y=48.87+3.36A+1.80B+0.64C+0.037AB+1.32AC-0.88BC-3.68A2-3.93B2+1.66C2

回归方程方差分析结果见表3，模型的F值为187.70，P值（P=0.003 0）小于0.01，表明模型较显著，在各因素交互作用中，A和B交互影响不显著，A和C交互影响极显著，B和C交互影响显著，说明各自两因素之间不是简单的线性关系，还存在二次关系。模型误差失拟P值（P=0.139 9）大于0.05，不显著，表明此方程对试验拟合度较好，具有一定的可靠性，模型预测值与实际值误差较小，可应用此回归模型对番木瓜籽蛋白提取效果进行分析及预测。

采用各因素的F值可评价此因素对试验指标的影响，F值越大，表明因素的影响越显著。由表3可知，F（A）=574.72，F（B）=165.20，F（C）=21.00，即各因素對番木瓜籽蛋白提取率影响为料液比>提取时间>功率。

由图4可看出，随因素A和B的取值不断增大，响应值的值先增大后减小，在A和B的中心点附近出现最大值。在料液比和提取时间交互作用等高线中，等高线沿A轴（料液比轴）的变化趋势明显高于B轴（提取时间轴），说明料液比对番木瓜籽蛋白提取的影响大于提取时间。

由图5、6可知，在C的作用下，随因素A、B值的增大，响应值不断增大，在中心点过后小幅度下降，波动不大，曲面呈马鞍状，且功率的响应面曲线坡度明显小于提取时间、料液比的响应面曲线坡度，此外，图5、6的等高线横坐标与纵坐标的趋势相比，可看出提取时间、料液比坐标较为陡峭，说明提取时间、料液比对番木瓜籽蛋白质提取率影响均大于功率对其的影响。

综上，各因素对番木瓜籽蛋白质提取率的影响主次顺序是料液比>提取时间>功率。

2.3 番木瓜籽蛋白性质结果

2.3.1 等电点 等电点的实验结果如图7所示。由图7可知，在pH4.56，620 nm处吸光值较小，故番木瓜籽蛋白的等电点pI=4.56。

2.3.2 溶解性 番木瓜籽蛋白在不同pH条件下的溶解度如图8所示，番木瓜籽蛋白质溶解性较差，这可能是因为其中的清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白等类型的蛋白含量及所占比例不同。番木瓜籽蛋白在pH4～5之间溶解度最小，据此可推番木瓜籽蛋白的等电点在4～5之间，此结果与等电点的测定结果相符。

2.3.3 起泡性 蛋白质的起泡能力多取决于其可溶部分，不溶性部分的蛋白质粒子因具有提高表面粘度的作用，也能在稳定泡沫的过程中发挥作用。此外，蛋白质水解产生的小分子多肽能增加起泡性；而不发生水解的蛋白质以及水解产生的大分子多肽则有抑制起泡的作用。不同浓度的番木瓜籽蛋白在不同pH下的起泡性如图9所示。

由图9可以看出，各浓度的蛋白质在pH4.5时的起泡性均最高，这是等电点附近产生较多的不溶解蛋白质粒子；在同pH下，随番木瓜籽蛋白浓度的增加，起泡性随之增加；相同浓度，不同pH下的起泡性有显著性差异，这是在不同的酸碱环境下，蛋白质水解程度以及水解产物不同。

2.3.4 乳化性 由图10可以看出，番木瓜籽蛋白乳化性在不同pH条件下差异较大，在等电点附近（pH4.5左右）的乳化性最低，pH增加，其乳化能力有所提高，这是因为随pH变化，蛋白质的溶解性发生变化，尤其在碱性条件下的溶解度增加，乳化能力增强。

2.3.5 持水性 番木瓜籽蛋白质的持水力测定结果表明，其持水能力较低，为（1.58±0.3）g/g，与椰子种皮蛋白质（1.50 g/g）[16]相当，但远低于其它作物种子[17]蛋白质的持水力，如紫苏籽[18]、南瓜籽[19]和大豆分离蛋白[20]的持水力分别为2.72、3.52、3.10 g/g。这可能是因为脱脂番木瓜籽蛋白质的溶解性相对较低，不利于蛋白质向气-水和油-水界面扩散，从而降低了其表面活性。

3 讨论

随着社会不断发展，蛋白资源日益紧缺，加强对植物蛋白资源的开发和利用具有重大的意义。邓楚津[6]等人对番木瓜籽进行成分分析，表明番木瓜籽蛋白中必需氨基酸种类齐全，且赖氨酸含量丰富，与谷物搭配可起蛋白质互补作用。查阅国内外文献资料，未见有关于番木瓜籽蛋白提取和利用的研究报道，本文通过单因素比较UAE与UAME对番木瓜籽蛋白提取，发现UMAE较UAE具有高效、快速的特点。石玮婷[21]采用微波辅助提取紫苏籽蛋白，在最佳工艺条件下提取率为25.85%。赵见军[22]等采用超声波辅助提取核桃粕蛋白，提取率达69.62%。使用微波辅助提取，所需时间一般较短，在数分钟可完成反应，达到提取的目的，这是因为微波辐射过程是高频电磁波穿透萃取介质到达物料内部的微管束和腺胞系统的过程，物料吸收了微波能，细胞内部的温度迅速上升，使得细胞内部压力过大导致细胞破裂，番木瓜籽蛋白自由流出。此外，微波产生的电磁场可加速番木瓜籽蛋白由物料内部向固液界面扩散的速率，从而缩短番木瓜籽蛋白由物料内部扩散至固液界面的时间，使萃取速率提高。

蛋白质性质测定结果表明，番木瓜籽蛋白的等电点pI4.56，pH4.5（即等电点附近）时起泡性最好，乳化性、溶解度最低，持水能力较低，为（1.58±0.3）g/g，与大豆分离蛋白的持水力相差较远。对番木瓜籽蛋白进行初步性质研究，可为番木瓜籽蛋白的加工及资源化利用提供依据。如将番木瓜籽蛋白作为食品添加剂添加至玉米等谷物制品中，不仅可填补谷物中缺少赖氨酸、络氨酸等必需氨基酸空白，还可提高食品的营养价值，并且具有改善其结构性能，利于人体吸收，同时可降低生产成本。试验表明，番木瓜籽蛋白具有一定的功能特性，但与大豆蛋白仍有一定差异，因此有必要加强对番木瓜籽蛋白研究，尤其是对其蛋白质类型分析，以期探索出适合番木瓜籽蛋白的加工技术路线，早日实现高值化利用。

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