地胆头化学成分及其生理活性的研究

范琼　邓爱妮　朱玉龙　周聪　赵敏　叶海辉

摘 要 研究地胆头提取液中总多酚和类黄酮含量及其生理活性。测定了不同地胆头提取液的总多酚含量、类黄酮含量及其清除DPPH自由基的能力，并比较了不同料液比的地胆头提取液对血管紧张素转化酶（ACE）的抑制率。结果表明：不同提取剂提取的地胆头总多酚和类黄酮含量不同，其中，丙酮提取液中总多酚和类黄酮含量分别为12.27 mg/g、7.50 mg/g，均高于乙醇、甲醇、水提取液中的总多酚和类黄酮含量；地胆头丙酮、甲醇、乙醇提取液对DPPH 自由基的清除率分别为94.60%、93.41%、90.87%，均高于人工合成氧化剂BHT（89.15%）和地胆头水提取液（62.75%）；地胆头提取液对ACE的抑制效果随着料液比的增加而越明显，其中，1 ∶ 10的料液比下，乙醇地胆头提取液对ACE抑制率达到96.67%。通过本研究得出，在地胆头乙醇、甲醇、水、丙酮4种提取液中，丙酮提取液的总多酚和类黄酮含量最高，且其抗氧化性效果最佳，乙醇地胆头提取液的抗高血压能力最强。地胆头提取液具有明显的抗氧化性和抗高血压等生理活性，在功能食品及中草药领域里具有良好的开发应用前景。

关键词 地胆头；化学成分；生物活性；抗氧化性；抗高血压

中图分类号 S567.23 文献标识码 A

Abstract The polyphenol content， flavonoid content and DPPH scavenging activity of Elephantopus scaber（ES）extracts were detected， and the angiotensin converting enzyme（ACE）scavenging activity of ES extracts at different ratio solid-to-solvent were compared. The polyphenol and flavonoid content from ES with different extraction solvent were different， the polyphenol and flavonoid content of acetone extract was 12.27 mg/g and 7.50 mg/g， both higher than that of the methanol extract， ethanol extract， water extract. The DPPH scavenging activity of ES acetone extract， methanol extract and ethanol extract was 94.60%， 93.41%， 90.87%， respectively， which was higher than the DPPH scavenging activity of ES water extract and BHT； With the increasing of ratio solid-to-solvent， the ACE scavenging activity of ES extracts was better， the ACE scavenging activity of ES ethanol extract represented 96.67% at ratio solid-to-solvent of 1 ∶ 10. Among the four ES extracts， more polyphenol and flavonoid content were extracted by acetone than methanol， ethanol and water. And the antioxidant activity of ES acetone extract was the best. ES ethanol extract showed the best anti-hypertension. ES has great potential for the development of functional foods and herbs due to its excellent antioxidant activity and anti-hypertension activity.

Key words Elephantopus scaber； chemical constituents； bio-activity； antioxidant activity； anti-hypertension

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.06.025

地膽头（Elephantopus scaber）别名苦地胆、土公英等，属多年生草本，是中国长江以南常用的民间草药，并收录于《海南常见中草药名录》。地胆头有清热解毒、利尿消肿、治急性黄疸型肝炎和肝硬化腹水等功效[1]。近代医学研究指出， 地胆头含有羽扇豆醇、豆甾醇和倍半萜类化合物——内酯、菊糖、果糖和氨基酸等化学成分， 其有效成分为倍半萜类化合物[2]。地胆头全草对痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌有抑制作用。在国外，利用地胆头治疗糖尿病、肿瘤和肝炎等研究较广泛[3-6]，在国内，对地胆头的研究大多是对其化学成分、微量元素、抗炎抗菌性和抗肿瘤等方面进行分析[7-10]。在实际运用上，中国已有多个含地胆头的复方制剂应用于临床。此外，因为具有独特香味及药用功效，地胆头作为煲汤辅料被中国南方多省地使用[11]。许多研究表明地胆头在保肝、抗糖尿病、抗高血压、抗肿瘤等生理活性上有巨大的潜在价值，但是目前对地胆头生理活性的整体性研究尚少见报道。

本研究定量测定了地胆头提取液中抗氧化成分总多酚和类黄酮的含量，并分别从DPPH清除率和ACE抑制率2方面对地胆头的生理活性进行评价，为地胆头资源的开发利用提供科研基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

地胆头全草，购于海南省儋州市红旗市场，野生品种，经鉴定为地胆头全草；没食子酸标准品（纯度97.8%，德国Dr.Ehrenstorfer公司），芦丁标准品（纯度99%，美国Sigma公司），血管紧张素转换酶（来自兔肺，≧2.0 units/mg，美国Sigma公司）；其他试剂均为分析纯。

仪器：HR5026植物粉碎机[飞利浦（中国）投资有限公司]，SHZ-B水浴恒温振荡器（常州诺基仪器有限公司生产），FD53热风循环式烘箱（德国Binder宾得公司生产），AE200 型电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司生产]，UV-3900 紫外可见分光光度计（日本岛津公司生产），TDL-5C离心机（上海安亭科学仪器厂生产）。

1.2 方法

1.2.1 地胆头提取液的制备 将地胆头洗净，于75 ℃烘干，过100目筛后存放于干燥阴凉处备用。

取4个500 mL锥形瓶，各加入地胆头粉末10 g，并分别加入200 mL蒸馏水、80%乙醇（V/V）、80%甲醇（V/V）、80%丙酮（V/V）等4种不同提取液，振荡12 h；取出后离心过滤，并分别用提取溶剂定容至200 mL，滤液分别为地胆头水提取液、乙醇提取液、甲醇提取液和丙酮提取液。提取液存放于4 ℃备用。

1.2.2 多酚含量的测定 没食子酸标准曲线的绘制：准确称取没食子酸标准品（0.100±0.001）g，用水完全溶解后，转移到100 mL容量瓶中定容，配制成浓度为1 000 mg/L的没食子酸标准溶液；分别吸取5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 mL标准溶液到50 mL容量瓶中，定容；分别吸取上述标准溶液0.1 mL，加10%福林酚显色剂5 mL，反应5 min后，加入7.5%碳酸钠溶液4 mL，混匀，室温下反应1.0 h；在750 nm波长下测定系列标准溶液的吸光度，绘制标准曲线，得回归方程为：y=0.001 3x+0.116 4（其中y为没食子酸含量，单位为mg，x为吸光度，R2=0.999 3），具有很好的线性关系。

提取液中总酚含量的测定：移取0.1 mL提取液，按照测定没食子酸标准溶液的方法，在750 nm波长下测定其吸光值，并根据标准曲线计算地胆头总多酚的没食子酸当量。以1 g地胆头干样中的没食子酸毫克当量表示多酚含量。

1.2.3 类黄酮含量的测定 芦丁标准曲线的绘制：准确称取芦丁标准品（0.100±0.001）g，用水完全溶解后，转移到100 mL容量瓶中定容，配制成浓度为1 000 mg/L的芦丁标准溶液；分别吸取3.0、6.0、8.0、10.0、14.0、16.0 mL标准溶液到100 mL容量瓶中，定容。

分别吸取0.5 mL地胆头提取液和芦丁标准液于10 mL比色管中，加入5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min；加入10%硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min；加入4%氢氧化钠溶液4 mL，再加水至刻度，密塞，摇匀，放置15 min；以相应试剂为空白对照，在波长510 nm处测定吸光值；绘制标准曲线，得回归方程为：y=0.002 6x+0.023 2（其中y为芦丁含量，单位为mg，x为吸光度，R2=0.997 7），具有很好的线性关系，并根据标准曲线计算地胆头类黄酮的芦丁当量。以1 g地胆头干样中的芦丁毫克当量表示类黄酮含量。

1.2.4 DPPH自由基清除率的测定 0.2 g/L DPPH溶液的配制：精确称取0.02 g DPPH，用无水乙醇溶解并定容于100 mL的棕色容量瓶中，此溶液浓度为0.2 g/L，即配即用。

BHT溶液的配制：精确称取0.1 g BHT，用甲醇溶解并定容于100 mL容量瓶中，即得浓度为1.0 g/L的BHT储备液。

DPPH自由基清除率测定：分别吸取0.1 mL对照空白溶液、地胆头提取液和BHT溶液，各加入0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH=7.4）0.4 mL，混匀；然后各加入0.5 mL浓度为0.2 g/L的DPPH溶液，混匀后在室温下反应20 min后，于最大吸收波长517 nm处以水为参比溶液，测定其吸光度，同时进行空白试验。并按下式计算清除率。

清除率/%=[1-■]×100

式中：A0為0.5 mL DPPH溶液与样品溶剂的吸光度；Ai为0.5 mL DPPH溶液与样品溶液的吸光度；Aj为0.5 mL 0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液与样品溶液的吸光度。

1.2.5 ACE抑制率的测定 ACE抑制率的测定参考Cushman等[12]的方法并稍作改动。用0.1 mol/L硼酸盐缓冲液（pH=8.3）将马尿酰-组胺酰-亮氨酸（HHL）配成5.0 mmol/L的溶液；在2 mL小离心管中分别加入150 μL的5 mmol/L的HHL溶液和100 μL的地胆头提取液，于37 ℃下保温5 min后，再加入50 μL ACE溶液（溶解于蒸馏水中，活力为0.1 U/mL），混匀后在37 ℃下保温60 min；加入200 μL 1.0 mol/L的盐酸溶液以终止反应，再加入1.5 mL乙酸乙酯，经15 s振荡混匀后，静置5 min；移取1.0 mL的乙酸乙酯层，烘箱烘干（90 ℃，90 min）后，加入1.5 mL蒸馏水，混匀后在228 nm处测定吸光度，同时进行空白试验。

对照试验：在2 mL小离心管中分别加入150 μL HHL溶液和100 μL的地胆头提取液，于37 ℃下保温5 min后，加入200 μL 1.0 mol/L盐酸溶液以终止反应；加入50 μL ACE溶液（溶解于蒸馏水中，活力为 0.1 U/mL），混匀后在37 ℃下保温60 min；再加入1.5 mL乙酸乙酯，经15 s振荡混匀后，静置5 min；移取1.0 mL的乙酸乙酯层，烘箱烘干（90 ℃，90 min）后，加入1.5 mL蒸馏水，混匀后在228 nm处测定吸光度。并按下式计算抑制率。

抑制率/%=[1-■]×100

式中：A0为提取溶剂和ACE反应的吸光度；Ai为地胆头提取液与ACE反应的吸光度；Aj为对照试验反应的吸光度。

1.3 数据处理

数据分析采用Origin 8.0软件处理，多重比较分析用SPSS 15.0软件。

2 结果与分析

2.1 地胆头提取液中的总多酚含量

酚类物质广泛存在于植物食品中，多酚物质具有特殊的生物活性，是强的抗自由基物质，其活性相当于VE的20倍[13]。地胆头不同提取液中多酚含量如表1所示，水提取液和80%甲醇提取液的多酚含量差异性不明显，其余样品间的多酚含量差异显著。80%丙酮提取液中的总多酚含量明显高于其他提取液的总多酚含量。水提取液、80%乙醇提取液、80%甲醇提取液、80%丙酮提取液中的总多酚含量分别为9.25、8.98、9.30、12.27 mg/g，这表明丙酮能更好地提取地胆头中的多酚物质。

2.2 地胆头提取液中的类黄酮含量

黄酮类化合物具有清除自由基、抗氧化、抗突变、抗肿瘤、抗菌、抗病毒和调节免疫、防治血管硬化、降血糖等功能[14]。从表2中可以得知，分别用水、80%甲醇、80%乙醇、80%丙酮溶液提取地胆头中的类黄酮，所得类黄酮含量从高到低顺序分别为80%丙酮提取液、80%甲醇提取液、80%乙醇提取液、水提取液，其类黄酮含量分别为7.50、5.63、5.27、4.21 mg/g，且各组样品之间的类黄酮含量差异显著。

2.3 地胆头去除DPPH自由基的清除率

自由基是游离存在的含有不配对电子的基团，它们在体内有很强的氧化反应能力，易对蛋白质、脂质和核酸等产生伤害，从而引起机体损伤[15]。从表3可知，80%乙醇提取液、80%甲醇提取液、80%丙酮提取液的DPPH自由基清除率分别为90.87%，93.41%，94.60%，高于BHT和水提取液对DPPH的清除率，BHT的DPPH自由基清除率为89.15%，水提取液的DPPH清除率为62.75%。同时，各个样品的DPPH清除率差异性明显。从试验结果可以得知，有机溶剂比无机溶剂提取的地胆头提取液具有更强的抗氧化性效果，这表明地胆头中的抗氧化性物质能更好地溶解于有机相溶剂中。

2.4 地胆头对血管紧张素转化酶（ACE）的抑制率

高血压严重危害着人类的健康，95%以上的患者是原发性高血压，而通过抑制ACE活性可以有效地降低原发性高血压的发生[16]。ACE主要参与肾素-血管紧张素-醛固酮系统的调节，ACE能催化血管紧张素Ⅰ转变为具强效升高血压作用的物质血管紧张素Ⅱ，同时，ACE将具降压作用的物质舒缓激肽降解，使之失去降压作用[17]。目前用于降血压的药物，其降血压原理主要是抑制ACE的活性。本研究中，在37 ℃下，往地胆头提取液中加入HHL反应5 min后，加入ACE，HHL在ACE的催化下快速分解成马尿酸和二肽HL，如果地胆头提取液对ACE活性有抑制效果，马尿酸和二肽的生产量会相应减少，通过测定马尿酸含量的减少量来计算地胆头对ACE的抑制率，评价地胆头的抗高血压效果。不同浓度的地胆头提取液对ACE的抑制效果见图1，不同料液比下地胆头提取液对ACE抑制率的多重比较分析见表4。从表中可以看出，在显著水平为0.05时，料液比为1 ∶ 25的80%乙醇提取液和料液比为1 ∶ 10的80%丙酮提取液对ACE的抑制率差异不显著，其余各组样品之间均差异显著。表4和图1表明，地胆头乙醇提取液对ACE的抑制效果最好，且随着料液比的增加，地胆头提取液对ACE的抑制率越高。当料液比为1 ∶ 10时，地胆头乙醇提取液的ACE抑制率达到96.67%，而水提取液和丙酮提取液对ACE的抑制率分别仅为53.33%和56.67%。

3 讨论

没有一种单一的方法能够充分地评价一种物质的生理活性，本试验采用多种方法从不同角度研究了地胆头的化学成分及其生理活性。试验结果表明，不同提取溶剂影响地胆头中的总多酚、类黄酮提取含量。不同溶剂提取液中总多酚含量由低到高分别为80%乙醇提取液、水提取液、80%甲醇提取液、80%丙酮提取液。不同溶剂提取液的類黄酮含量排序为水提取液<80%乙醇提取液<80%甲醇提取液<80%丙酮提取液，说明80%丙酮溶剂能更好地提取地胆头中总多酚和类黄酮，其含量分别为12.27 mg/g、7.50 mg/g。在其他南药研究中，祁静[18]发现槟榔提取工艺经优化后得到的多酚提取率为14.96 mg/g，王呈文等[19]研究发现牛大力的黄酮类含量为5.52 mg/g，由此可以看出，在南药中地胆头含有相对较高的总多酚和类黄酮含量。

本研究结果表明，80%丙酮地胆头提取液对DPPH自由基的清除率达94.60%，均高于80%乙醇、80%甲醇、水地胆头提取液；有机溶剂提取液对DPPH自由基的清除率均高于人工氧化剂BHT，说明地胆头有机溶剂提取液有着明显的抗氧化效果，其原因可能与地胆头提取液中的总多酚和类黄酮含量有关，因为类黄酮和总多酚物质具有很强的抗氧化效果[20-21]。温先敏等[22]研究发现，地胆头水提物具有较强的抗炎镇痛作用，说明地胆头具有一定的抗氧化性效果，本研究结果与文献报道相符。此外，本研究结果表明，不同溶剂提取液对ACE的抑制率从低到高分别为水提取液、80%丙酮提取液、80%乙醇提取液，且随着料液比的增加，其对ACE的抑制率增强，在料液比为1 ∶ 10时，80%乙醇提取液对ACE的抑制率达到96.67%，具有非常明显的抗高血压效果。梁侨丽等[23]研究发现地胆头对肿瘤细胞增殖具有一定的抑制作用，表明地胆头有抗氧化、抗肿瘤等生理活性。

以上各方面试验结果表明，在南药中地胆头含有相对较高的抗氧化成分，并具有明显的抗氧化和抗高血压等生理活性。由此可见，地胆头作为一种天然药食同源植物具有巨大的开发及利用潜力。

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