五指毛桃抗炎活性成分的分离及鉴定

吕镇城　陈康　彭永宏

摘 要 以对5-LOX的抑制活性为抗炎活性评价指标，在活性跟踪下从五指毛桃中分离到6个化合物，经波谱数据分析后被鉴定为：羽扇豆醇棕榈酸酯（1）、β-香树脂醇乙酸酯（2）、补骨脂素（3）、芹菜素（4）、壬二酸（5）和胡萝卜苷（6），其中，化合物5、1对5-LOX表现出强的抑制活性，半数抑制浓度（IC50）分别为13.74 μg/mL和13.96 μg/mL；化合物1为首次从五指毛桃中分离得到。本研究结果可为五指毛桃的抗炎作用研究及其临床应用提供理论参考。

关键词 五指毛桃；抗炎活性；5-LOX 抑制活性；化学成分；结构鉴定

中图分类号 R284.2 文献标识码 A

Abstract To investigate the anti-inflammatory activity of the roots of Ficus hirta Vahl. 5-lipoxygenase（5-LOX）inhibitory activity was selected as the evaluation index. Six compounds were separated from this material by 5-lipoxygenase inhibitory activity-guided isolation. Their structures were identified as lupeol palmitate（1）， β-amyrin acetate（2）， psoralen（3）， apigenin（4）， azelaic acid（5）， daucosterol（6）on the basis of NMR spectroscopic analyses. Compound 5 and 1 exhibited strong in vitro inhibitory activity on 5-LOX with IC50 values 13.74 μg/mL and 13.96 μg/mL， respectively. Compound 1 was reported for the first time from F. hirta roots. The results may provide theoretical supports for the anti-inflammatory effect and clinical application of F. hirta roots.

Key words Ficus hirta Vahl. roots； anti-inflammatory activity； 5-LOX inhibitory activity； chemical constituents； structure identification

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.06.024

五指毛桃（Ficus hirta Vahl.）别名五爪龙，是桑科（Moraceae）植物粗叶榕的干燥根，为岭南习用草药。据中医典籍记载，五指毛桃性平，味甘、辛，有健脾补肺、利湿舒筋之功[1]。作为中医常用中药，五指毛桃临床上被用于脾虚浮肿、肺痨咳嗽、盗汗、慢性盆腔炎等症，在民间特别是岭南地区也被广泛用于保健养生，其药食两用历史悠久[2-3]。

目前，人们已经从五指毛桃中分离鉴定出多种化合物，如香豆素、黄酮、烯萜、甾醇和皂苷等[4-6]。笔者的前期研究发现，五指毛桃具有良好的抗肿瘤作用[7]。此外，笔者还发现五指毛桃具有良好的5-脂氧合酶（5-lipoxygenase，5-LOX）抑制活性。5-LOX是生物体内一种重要的双加氧酶，是催化花生四烯酸生成白三烯类（leukotrienes，LTs）的关键酶，LTs是重要的炎症介质，在许多疾病中扮演着重要的角色[8]。近年来，许多学者致力于以5-LOX为靶标来开发5-LOX抑制剂，从而为抗炎药物的研发提供理论依据。但是，五指毛桃的抗炎活性成分至今尚未明确。因此，本研究以5-LOX抑制活性为指标，在活性跟踪下对五指毛桃抗炎活性物质的化学成分进行分离纯化和结构鉴定，以明确其抗炎活性成分，为深入研究五指毛桃的抗炎作用机理及其在临床上的应用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂 五指毛桃由广东省河源五指毛桃GAP生产基地提供，经华南师范大学彭永宏教授鉴定后可知其为桑科植物粗叶榕的干燥根，凭证标本（编号15023）保存于华南师范大学生命科学学院。

薄层色谱硅胶及柱色谱硅胶（青岛海洋化工厂）；Sephadex LH-20（GE Healthcar公司）；5-LOX和去甲二氢愈创木酸（NDGA）（Cayman 公司）；其它试剂为分析纯。

1.1.2 仪器设备 Bruker DRX-600型超导核磁共振仪（瑞士Bruker公司）；RY-1G熔点仪（天津市新天光分析仪器技术有限公司）；RV10旋转蒸发仪（德国IKA公司）；UV-2450紫外可见分光光度计 （日本岛津公司）。

1.2 方法

1.2.1 提取与分离 取10 kg五指毛桃，用95%乙醇提取3次，每次7 d，经减压浓缩得提取物浸膏；用水将浸膏分散后，依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，分别得到石油醚部浸膏224 g，乙酸乙酯部浸膏171 g，水部浸膏445 g。由于乙酸乙酯部的5-LOX抑制活性最好，因此，选择乙酸乙酯部进行分离纯化。乙酸乙酯部171 g经硅胶柱以石油醚 ∶ 乙酸乙酯（V ∶ V=5 ∶ 1～1 ∶ 10）梯度洗脱，收集到20个馏分Fr1～Fr20，并选择活性强的Fr4、Fr5、Fr8和Fr17 4个馏分作进一步的分离纯化。Fr4馏分先后以石油醚-氯仿（V ∶ V=7 ∶ 3）经硅胶柱反复层析后得化合物1（0.29 g），经Sephadex LH-20柱层析得化合物2（0.048 g），以石油醚-氯仿-乙酸乙酯（V ∶ V ∶ V=5 ∶ 3 ∶ 1）經硅胶柱反复层析后得化合物3（4.63 g）。Fr5馏分以石油醚-氯仿-甲醇（V ∶ V ∶ V=6 ∶ 10 ∶ 1）经硅胶柱反复层析后得化合物4（0.43 g）。Fr8馏分以氯仿-乙酸乙酯（V ∶ V ∶ =7 ∶ 5）经硅胶柱反复层析后，上Sephadex LH-20柱层析，得化合物5（0.28 g）。Fr17馏分以石油醚-氯仿-甲醇（V ∶ V ∶ V=3 ∶ 10 ∶ 1）经硅胶柱反复层析后得化合物6（0.27 g）。

1.2.2 5-LOX抑制活性测定 5-LOX抑制活性测定参考Gaffney[9]的方法，NDGA为阳性对照，抑制率按下列公式计算：

抑制率/%=[（A0-A1）/A0]×100，其中A0和A1分别表示空白组和处理组。

2 结果与分析

2.1 结构鉴定

在活性跟踪下，对五指毛桃活性成分进行分离纯化，从中得到6个化合物，并结合光谱分析法鉴定其结构（图1）。

化合物1：白色粉末， m.p. 54～56 ℃， 分子式为C46H80O2。1H-NMR（400MHz， CDCl3）δH： 0.77 （3H， s， H-24）， 0.83（3H， s， H-28）， 0.86 （3H， s， H-25）， 0.92（3H， s， H-27）， 1.01（3H， s， H-26）， 1.24（3H， s）， 1.67（3H， s， H-30）， 2.27 （lH， d， H-19）， 4.46 （lH， dd， H-3）， 4.56（lH， br d， J=6 Hz， H-29a）， 4.67（lH， br d， J=6 Hz， H-29b）. 13C-NMR（100MHz， CDCl3）δC： 80.6（C-1）， 23.7（C-2）， 38.3（C-3）， 37.8（C-4）23.7（C-5）， 23.7（C-6）， 55.4（C-7）， 16.7（C-8）， 34.8（C-9）， 40.8（C-10）， 18.2（C-11）， 42.8（C-12）， 14.5（C-13）， 27.4（C-14）， 35.5（C-15）， 43.0（C-16）， 18.0（C-17）， 40.0（C-18）， 29.8（C-19）， 48.0（C-20）， 150.9（C-21）， 109.3（C-22）， 20.9（C-23）， 48.3（C-24）， 37.8（C-25）， 25.2（C-26）， 22.6（C-27）， 50.3（C-28）， 37.1（C-29）， 16.2（C-30）， 22.7（C-31）， 31.9（C-32）， 29.3（C-33）， 29.6（C-34）， 29.6（C-35）， 29.6（C-36）， 29.7（C-37）， 29.7（C-38）， 29.7（C-39）， 29.8（C-40）， 29.2（C-41）， 29.2（C-42）， 25.1（C-43）， 34.2（C-44）， 173.7（C-45）， 14.1（C-46）。以上波谱数据与文献[10]报道基本一致，故鉴定化合物1为羽扇豆醇棕榈酸酯，该化合物为首次从五指毛桃中分离得到。

化合物2：白色粉末，m.p. 238～240 ℃，分子式C32H52O2。 1H-NMR（400MHz， CDCl3）δH： 0.79（3H， s）， 0.87（3H×2， d）， 0.92（3H， s）， 0.97（3H， d）， 1.00（3H， s）， 1.06（3H， s）， 2.05（3H， s， -OCOCH3）， 4.50（1H， m， H-3）， 5.18（1H， t， H-12）. 13C-NMR（100MHz， CDCl3）δC： 38.4（C-1）， 23.2（C-2）， 80.9（C-3）， 37.7（C-4）， 55.2（C-5）， 18.2（C-6）， 32.8（C-7）， 40.0（C-8）， 46.7（C-9）， 36.7（C-10）， 23.6（C-11）， 124.3（C-12）， 139.6（C-13）， 42.0（C-14）， 28.7（C-15）， 26.1（C-16）， 33.7（C-17）， 59.0（C-18）， 39.6（C-19）， 39.6（C-20）， 31.2（C-21）， 41.5（C-22）， 28.0（C-23）， 16.8（C-24）， 15.5（C-25）， 16.8（C-26）， 23.3（C-27）， 28.7（C-28）， 17.5（C-29）， 21.4（C-30）， 21.3（C-31）， 171.0（C-32）。以上波谱数据与文献[11]报道基本一致，故鉴定化合物2为β-香树脂醇乙酸酯。

化合物3：白色固体，m.p. 161～163 ℃，分子式C11H6O3。1H-NMR（400MHz， CDCl3）δH： 6.31（1H，d， J=10.1Hz， H-4）， 6.79（1H， d， J=2.2Hz， H-9）， 7.39（1H， s， H-13）， 7.63（1H， s， H-10）， 7.70（1H， d， J=2.2Hz， H-7）， 7.77（1H， d， J=9.6Hz， H-5）. 13C-NMR（100MHz， CDCl3）δC：161.0（C-1）， 114.5（C-2）， 144.1（C-3）， 119.8（C-45）， 124.8（C-5）， 156.3（C-6）， 99.7（C-7）， 151.9（C-8）， 115.3（C-9）， 106.4（C-10）， 146.9（C-11）。以上波谱数据与文献[12]报道基本一致， 故鉴定化合物3为补骨脂素。

化合物4：黄色粉末，m.p. > 300 ℃，分子式C15H10O5。1H-NMR（400MHz， DMSO-d6）δH： 12.97（1H，s， 5-OH）， 10.82（1H， brs， OH）， 10.37（1H， brs， OH）， 6.80（1H， s， H-3）， 6.19（1H， J=2.1Hz， H-6）， 6.48（1H， d， J=2.1Hz， H-8）， 7.93（2H， d， J=8.7Hz， H-2， 6）， 6.93（2H， d， J=8.7Hz， H-3， 5）. 13C-NMR（100MHz， DMSO-d6）δC： 164.1（C-1）， 103.2 （C-2）， 182.2（C-3）， 161.8（C-4）， 99.2（C-5）， 164.5（C-6）， 94.4（C-7）， 157.7（C-8）， 104.1（C-9）， 121.6（C-1′）， 128.9（C-2′）， 116.4（C-3′）， 161.6（C-4′）， 116.4（C-5′）， 128.9（C-6′）。以上波譜数据与文献[13]报道基本一致，故鉴定化合物4为芹菜素。

化合物5：白色粉末，m.p. 101～102 ℃，分子式C9H16O4。1H-NMR（400MHz， CD3OD）δH： 2.24-2.27（4H， t， J=7.2Hz， H-2， 8）， 1.54-1.59（4H， M， H-3， 7）， 1.37-1.53（6H， m， H-4， 5， 6）. 13C-NMR（100MHz， CD3OD）δC： 176.3（C-1， 9）， 33.6（C-2， 8）， 24.6（C-3， 7）， 28.6（C-4， 5， 6）。以上波譜数据与文献[14]报道基本一致，故鉴定化合物5为壬二酸。

化合物6：白色粉末，m.p. 289～290 ℃，分子式C35H60O6。1H-NMR（400MHz， DMSO-d6）δH： 0.88-0.94（9H， m， 3×CH3）， 0.96（3H， s， 26-H）， 0.99（3H， d， 21-H）， 1.12（s， CH3-19）， 1.45（s， CH3-20）， 1.77（s， CH3-18）， 2.48（m， H-4）， 2.88（m， H-4）， 3.11（m， glc-2）， 3.33（m， glc-5）， 3.36-3.38（m， glc-3， glc-4）， 3.40（m， H-3）， 3.45（dd， J=11， 4.4Hz， glc-6a）， 3.62（dd， J=11， 3.3Hz， glc-6b）， 4.43（d， J=7.3Hz， glc-1）， 5.31（brd， J=4.5Hz， H-6）. 13C-NMR（100MHz， DMSO-d6）δC： 36.64（C-1）， 29.69（C-2）， 77.28（C-3）， 39.50（C-4）， 140.84（C-5）， 121.89（C-6）， 31.84（C-7）， 31.80（C-8）， 50.01（C-9）， 39.2（C-10）， 20.16（C-11）， 39.29 （C-12）， 42.27（C-13）， 56.59（C-14）， 24.49（C-15）， 29.69（C-16）， 55.83（C-17）， 11.95（C-18）， 19.54（C-19）， 39.92（C-20）， 19.19（C-21）， 34.20 （C-22）， 26.39（C-23）， 45.54（C-24）， 29.09（C-25）， 18.99（C-26）， 19.95（C-27）， 20.16（C-28）， 12.14（C-29）， 101.75（C-1′）， 77.28（C-2′）， 77.18 （C-3′）， 70.49（C-4′）， 73.88（C-5′）， 61.83（C-6′）。以上波谱数据与文献[15]报道基本一致，故鉴定化合物6为胡萝卜苷。

2.2 对5-LOX的抑制活性测定结果

不同极性浸膏对5-LOX的抑制活性（图2）显示，乙酸乙酯部的活性最好，IC50值为34.28 μg/mL。以NDGA为阳性对照，测定6个化合物对5-LOX的IC50值（表1），结果显示化合物1和5表现出良好的抑制活性，IC50值分别为13.96和13.74 μg/mL。化合物3次之，IC50值为28.11 μg/mL。化合物2、4、6的活性相对较弱，IC50值分别为49.97、44.41和35.56 μg/mL。

3 讨论

在5-LOX抑制活性的跟踪下，对五指毛桃抗炎活性成分进行分离纯化，从中得到6个化合物，并运用光谱法鉴定其结构。化合物1（羽扇豆醇棕榈酸酯）和化合物5（壬二酸）表现出良好的活性，其中化合物1为首次从五指毛桃中分离得到。壬二酸在临床上常用于治疗痤疮，其作用机制是通过清除皮孔上的细菌而实现[16-17]。此外，壬二酸还能降低被认为是促进痤疮细菌生长的角质蛋白的累积[17]。羽扇豆醇棕榈酸酯是羽扇豆醇的衍生物，后者是被认为具有抗炎及抗癌作用的烯萜类化合物[18]。研究指出，羽扇豆醇棕榈酸酯对胰蛋白酶具有抑制活性，是胰蛋白酶的非竞争性抑制剂[19-20]。此外，羽扇豆醇棕榈酸酯还能够通过显著降低乳酸脱氢酶的释放来改善关节炎症状[21]。

综上，以对5-LOX的抑制活性为指标，考察五指毛桃的抗炎活性成分，从中分离得到6个化合物，其中壬二酸和羽扇豆醇棕榈酸酯对5-LOX表现出强的抑制活性，羽扇豆醇棕榈酸酯为首次从该植物中分离得到，并首次报道这2个化合物对5-LOX具有抑制活性，可为深入研究五指毛桃的抗炎作用机理及其临床应用提供理论参考。

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