1株四环素降解菌的分离鉴定及降解特性研究

黄建凤， 张发宝， 逄玉万， 黄巧义， 唐拴虎

(广东省农业科学院农业资源与环境研究所 农业部南方植物营养与肥料重点实验室广东省养分资源循环利用与耕地保育重点实验室，广东 广州 510640)

1株四环素降解菌的分离鉴定及降解特性研究

黄建凤， 张发宝*， 逄玉万， 黄巧义， 唐拴虎

(广东省农业科学院农业资源与环境研究所 农业部南方植物营养与肥料重点实验室广东省养分资源循环利用与耕地保育重点实验室，广东 广州 510640)

应用微生物降解四环素具有经济有效和环境友好特点，已成为当前研究的热点。采用选择性培养基，从鸡粪中分离出1株能以四环素作为唯一碳源生长的菌株TC-1，培养7 d降解率为56.2%，初步鉴定为蜡状芽胞杆菌(Bacilluscereus)。从碳氮源组合、培养基初始pH、NaCl浓度和装液量四方面研究了TC-1降解四环素的特性。结果表明，TC-1在以葡萄糖和酵母粉为碳、氮源生长时效果最优，培养7 d时OD600达2.17；但最优降解率出现在蔗糖和大豆蛋白胨的碳氮源组合中，为46.8%。当培养基初始pH为7时，菌株TC-1生长最好，OD600为0.44，四环素降解率为92.3%。当培养基中NaCl浓度达15 g/L时，TC-1生长受到抑制，降解率仅为28.6%；培养基装液量为40%时降解率最高，为56.2%。

四环素降解菌；分离；鉴定；降解率；降解特性

鸡粪中的饲料残留物含有用作药剂的抗生素，对环境安全存在潜在威胁。抗生素的应用可促进动物的生长并治疗动物疾病[1]。我国每年抗生素原料生产量约21万t，其中9.7万t(46.1%)用于畜牧养殖业，而四环素类抗生素在我国兽药抗生素中生产和使用比例均为最大[2]。研究表明，30%～90%的四环素类抗生素不能被动物完全吸收，将以原型或母体化合物的形式排出体外，这些抗生素作为外源性化合物对环境生态将产生深远影响，严重者甚至对人类生存和健康造成危害[3-5]。为降低甚至消除残留四环素类抗生素的危害，目前国内外采用的处理方法主要包括生物降解和非生物降解。其中非生物降解虽然反应迅速，去除率高，但其中应用的化学材料对环境也存在一定程度的毒副作用，不利于该方法的可持续应用[6-7]。生物降解的主要方式有微生物降解、植物降解及植物-微生物复合降解。抗生素在环境中最主要的降解途径是微生物降解，其中发挥主要作用的是抗药细菌或真菌[8-9]。与其他处理方法相比，利用微生物处理抗生素残留物，条件简单、容易控制、成本较低、专一性较强且不会引起二次污染，是目前最为经济有效的方法，也是当前研究的热点。在现有的研究中，已有部分报道能够降解四环素的单一微生物菌株。如许晓玲等[10]筛选得到的缺陷短波单胞菌(Brevundimonasdiminuta)和人苍白杆菌(Ochrobactrumanthropi)；马志强等[11]和冯福鑫等[12]从抗生素药厂残留物中筛选到四环素高效降解菌无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacteramalonaticus)和酵母菌Trichosporonmycotoxinivorans，经过优化培养后降解率分别达86.1%和83.63%。但综观已有的研究报道，降解菌的种类和数量仍很缺乏，因此，亟需筛选更多的有效菌株提高降解菌资源库的多样性。本研究从鸡粪中筛选出1株能以四环素作为唯一碳源生长的细菌，系统地研究了该菌的分类地位及其降解四环素的效果和特性，以期为该菌株在畜禽粪堆肥化中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 筛菌材料 新鲜鸡粪。

1.1.2 试剂与仪器 四环素购自北京百灵威科技有限公司，纯度为97%。检测四环素残留量所用仪器为高效液相色谱仪(Waters e2695)，色谱柱为Waters X-Bridge C18，粒径3.5 μm，4.6 mm×150 mm，洗脱剂乙腈和三氟乙酸均为色谱纯，其余试剂为分析纯。

1.1.3 培养基 选择性培养基OS：Na2HPO47.01 g，KH2PO46.8 g，MgSO4·7H2O 1.19 g，(NH4)2SO41.2 g，CaCl2·7H2O 88 mg，FeSO4·7H2O 7.0 mg，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.2 mg，Na-EDTA 2.5 mg，ZnSO4·7H2O 1.11 g，MnSO4·6H2O 1.54 mg，CuSO4·5H2O 0.39 mg，Na2B4O7·10H2O 0.18 mg，水1 L，121 ℃灭菌20 min；种子液培养基TSA：胰蛋白胨15 g，大豆蛋白胨5 g，NaCl 5 g，水1 L，调pH 7.1～7.5，121 ℃灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 四环素降解菌的分离和筛选 在250 mL三角瓶中装45 mL去离子水，121 ℃灭菌20 min，待用。称取5 g鸡粪堆肥样品，加入上述三角瓶中，170 r/min、30 ℃摇床培养48 h，吸取1 mL悬液转接至新鲜的50 mL OS培养基中(含四环素浓度50 mg/L)，170 r/min、30 ℃摇床培养48 h；再次转接1 mL菌悬液至新鲜的50 mL OS培养基中(含四环素浓度100 mg/L)；同样的方法继续依次转接至含150 mg/L和200 mg/L四环素的OS培养基中，获得驯化的四环素降解菌液。将驯化的培养液按照10-1、10-2和10-3稀释度涂布到含150 mg/L四环素的选择性培养基平板上，每个稀释度设3个重复，30 ℃培养48 h，根据菌落形态挑选不同的菌株进行进一步的分离纯化，直至获得单菌落。

1.2.2 四环素降解菌的鉴定 细菌DNA提取采用试剂盒提取方法，所用试剂盒由天根生化科技有限公司提供。菌株16S rRNA基因片段采用PCR扩增，所用引物由上海英潍捷基贸易有限公司合成，引物序列：27f：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492r：GGTTACCTTGTTACGACTT。PCR反应体系为50 μL：dNTP 4 μL，10×buffer 5 μL，MgCl25 μL，模板DNA 1 μL，引物各1 μL，Taq酶0.5 μL，双蒸水32.5 μL。PCR扩增条件：预变性94 ℃ 5 min；变性94 ℃ 30 s，退火52 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min，30个循环；终延伸72 ℃ 10 min；保温 10 ℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测合格后送样测序，测序由上海英潍捷基贸易有限公司完成，所得测序结果上传NCBI与GenBank中的序列进行Blast比对分析，构建菌株系统发育树。

1.2.3 四环素含量的测定 标准储备液的配制：准确称取四环素20 mg，用乙醇溶解并定容至1 L，配成浓度为20 mg/L的标准储备液，置于4 ℃冰箱保存备用。标准溶液的配制：准确吸取标准储备液0、5、10、20、30、40、50 μL置于10 mL容量瓶中，用流动相定容至刻度，得到抗生素标准浓度系列为0、10、20、40、60、80、100 μg/L。高效液相色谱分离条件包括：采用色谱仪Waters e2695，色谱柱Waters X-Bridge C18，粒径3.5 μm，4.6 mm×150 mm，流动相为A：0.1%三氟乙酸(TFA)，B：乙腈，柱温为 30 ℃，流速为 0.5 mL/min，检测波长为352 nm，进样量10 μL，每个样品设3个重复。根据培养基中四环素的残留量可计算出每处理对四环素的降解率，计算公式：四环素降解率(%)=((四环素初始含量-残留量)/初始含量)×100%。

1.2.4 四环素降解菌的降解效果及特性研究 挑取TC-1的单菌落接种于种子液培养基TSA中，170 r/min、30 ℃摇床培养过夜，转接至含四环素浓度为100 mg/L的OS培养基中，170 r/min、30 ℃摇床培养7 d，每天取样测定菌液的OD600值及其中四环素残留量。研究了外加碳/氮源对菌株生长和四环素降解的影响，供试碳源包括葡萄糖、蔗糖、乳糖和麦芽糖；氮源包括尿素、酵母粉、大豆蛋白胨和胰蛋白胨。将不同的碳氮源进行组合，共16个处理，碳氮源添加量均为1 g/L。将所筛选细菌在TSA液体培养基中活化12 h后，按照2%的接种量向培养基中加入菌悬液，170 r/min、30 ℃摇床培养7 d后测定培养液中菌株的OD600值和四环素残留量。研究了pH、NaCl浓度和装液量对菌株生长和四环素降解的影响，将所筛选细菌在TSA液体培养基中活化12 h后，按照2%的接种量向选择性培养基中接入菌悬液，分别设置不同的pH值(3、4、5、6、7、8、9、10)、NaCl质量浓度(0、5、10、15、20、25、30 g/L)和装液量(20%、40%和60%)，170 r/min、30 ℃摇床培养7 d后测定培养液中菌株的OD600值和四环素残留量。

2 结果与分析

2.1 降解菌株的分离鉴定

以鸡粪作为筛菌来源， 在含四环素的选择性培养基中最终筛选获得1株能以四环素为唯一碳源生长的菌株，编号为TC-1。将菌株TC-1的16S rRNA序列在GenBank中进行比对，结果表明，菌株TC-1与蜡状芽胞杆菌BacilluscereusC3的序列相似性最大，为99%，两者在系统发育树上处于同一分支，亲缘关系最近，初步将其鉴定为蜡状芽胞杆菌(图1)。

图1 菌株TC-1的系统发育树Fig.1 Phylogenic tree based on the 16S rRNA gene sequence homology of TC-1

2.2 菌株TC-1对四环素的降解效果

以四环素作为唯一碳源连续培养7 d后，菌株TC-1的四环素降解率达56.2%(图2)。在连续培养的7 d中，TC-1生长的OD600持续上升，前3 d增长迅速，在第3天时OD600达0.15，随后4 d长势变缓，至培养结束时OD600为0.25。四环素降解趋势与TC-1的生长趋势一致，降解率随着培养时间增加而上升，且在培养3～6 d的过程有一段急速增长的趋势，至第7天时趋于平稳。分析原因可能是虽然菌株在培养后期仍持续生长，但趋势明显减弱，至第7天后可能逐渐趋于平稳，利用四环素的效果趋于稳定，因此降解率不再持续增长。

图2 菌株TC-1在以四环素为唯一碳源的培养基中的生长及降解曲线Fig.2 Utilization of tetracycline as a sole source of carbon for growth and tetracycline-degradation by strain TC-1

2.3 菌株TC-1对四环素的降解效果

在供试的4种碳源中，TC-1在葡萄糖中的生长情况总体较好，除与尿素氮源组合外，其余3种组合的OD600值均显著高于其他处理(P<0.05)，其中最小值为1.97(葡萄糖与大豆蛋白胨的组合)，显著高于其余处理中的最大值1.69(酵母粉与麦芽糖的组合)(P<0.05)。但四环素降解率偏低，原因可能是处理存在“葡萄糖效应”，与冯福鑫等[12]的报道一致。以尿素为氮源的处理中，当碳源为葡萄糖和麦芽糖时，四环素的降解率显著高于其他处理。有研究表明，尿素可降解生成NH4+，由此可使培养基的pH迅速升高至10，此时四环素易发生异构化，可能形成二甲胺、氨和水杨酸的降解产物。尿素与四环素可形成不溶性的复合物，从而降低溶液中母体的浓度[13]。葡萄糖与酵母粉的组合生长情况最好，OD600达2.17；此外，酵母粉分别与4种碳源组合的生长情况均显著高于其他氮源(P<0.05)(图3A)。最优降解率出现在蔗糖和大豆蛋白胨组合中，表现为46.8%(图3B)。添加碳氮源后菌株对四环素的降解率却低于未添加前的效果，尤其是以葡萄糖为碳源的处理菌株生长良好，菌株优先选择利用加入的碳氮源，对四环素的利用反而相对减少，从而造成降解率偏低。

图3 外加碳氮源对菌株TC-1的生长(A)及四环素降解(B)的影响Fig.3 Effect of exotic carbon and nitrogen sources on growth (A) and tetracycline-degradation capacity (B) by strain TC-1

2.4 不同培养条件对菌株TC-1降解四环素的影响

培养基的初始pH值对TC-1的四环素降解率影响最大(图4)。对照初始pH为6，培养7 d后TC-1对四环素的降解率为55.2%；随着pH值升高或降低，四环素降解率均大于或等于72.4%(pH=3)，显著高于对照，最高降解率出现在pH为9时，达100%。不同的初始pH对TC-1的生长有一定的影响，培养7 d后对照OD600为0.29。当pH为7时，TC-1的生长较对照显著提升，OD600达0.44；但其余处理下，TC-1生长受抑制，其中在偏酸性条件下的生长受抑制强度小，最小值出现在pH=3时，为0.21；当初始pH达9和10时，TC-1的生长受到显著抑制，OD600分别仅为0.14和0.13(图4A)。

培养基中NaCl浓度升高对TC-1的生长和降解效果均有一定影响(图4B)，当NaCl质量浓度为5 g/L时，TC-1生长受到抑制，但四环素降解率升高，可能因为一定的NaCl质量浓度对菌株的生长造成胁迫，反而促使TC-1更有效地利用四环素作为碳源生长以提高对逆境的抵抗力。然而，随着NaCl质量浓度的增加，TC-1生长和降解率均受到不利影响。当NaCl质量浓度达15 g/L时，TC-1的四环素降解效果开始显著受到抑制，此时的降解率仅为28.6%；随着NaCl质量浓度升至25 g/L和30 g/L，四环素的降解率急速下降，分别低至15.4%和16.8%。

通过改变三角瓶中培养基的装液量可初步研究供氧量对菌株TC-1降解四环素的影响(图4C)。当装液量为40%时，菌株的生长和四环素降解率较20%装液量有所增长，但在达到60%装液量时两者均受到显著抑制，此时TC-1的OD600和降解率分别为0.19和50.0%。因此可知，装液量过高不利于菌株TC-1的生长，可能因为此时瓶中的供氧量过低，不足以支持菌株的生长，表明TC-1是好氧型菌株。

图4 培养基pH值(A)、NaCl质量浓度(B)和装液量(C)对菌株TC-1生长及四环素降解的影响Fig.4 Effect of pH value (A), NaCl concentration (B) and liquid volume (C) on the growth and tetracycline-degradation capacity of strain TC-1

3 讨 论

在抗生素易残留的废弃物如制药残渣或污水中可以筛选到四环素降解菌，其原因在于这类来源中残留的大量抗生素对定殖其中的微生物产生胁迫，它们必需对这些抗生素有强烈的耐受性才能得以存活和繁殖，因此从中较易筛选到有降解抗生素能力的菌株[14]。本研究选用的鸡粪含有饲料残留物，其中四环素作为应用最广泛的抗生素之一，是残留抗生素的主要成分，对其中存活的微生物造成一定胁迫，因此筛选原理与已报道的抗生素药渣一致。应用选择性培养基分离得到1株四环素降解菌，编号为TC-1，该菌株在培养7 d后对四环素的降解率为56.2%。在此过程中，菌株的生长逐渐受到抑制。李伟明等[8]提出，四环素类抗生素发生降解可能会产生对环境毒性更大的代谢及降解产物。TC-1生长受阻可能正是由于四环素母体被降解后代谢产生了具有高毒性的中间产物，这些产物的累积限制了菌株的继续生长。有关四环素降解产物的形态及毒性有待进一步研究。

经初步鉴定，本研究筛选获得的四环素降解菌株为蜡状芽胞杆菌Bacilluscereus。目前已有大量研究报道了蜡状芽胞杆菌在降解环境污染物上的作用，如有机磷农药、苯酚和芘污染物[15-17]。蜡状芽胞杆菌是一种好氧、中温和产芽胞的革兰阳性杆菌，具有很强的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等活性，能产生抗菌素，还可作为生防菌防控土传病害的发生，目前报道防控的病害有土传青枯病和多种常见真菌性病害[18]。此外，蜡状芽胞杆菌对重金属镉、铬和铅等有强的耐受性[19]。然而，有关蜡状芽胞杆菌降解抗生素的研究未见报道。目前报道的四环素降解菌的种类包括缺陷短波单胞菌(Brevundimonasdiminuta)和人苍白杆菌(Ochrobactrumanthropi)、无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacteramalonaticus)和酵母菌Trichosporonmycotoxinivorans等[10-12]，但未见有关蜡状芽胞杆菌降解抗生素的报道。本研究结果表明，蜡状芽胞杆菌TC-1能以四环素作为唯一碳源生长，具有降解性能，丰富了四环素降解菌资源库。

研究菌株TC-1降解特性时发现，外源添加葡萄糖碳源有利于菌株的生长，但降解率却并未随之升高，存在“葡萄糖效应”，与冯福鑫等[12]的报道一致。在各项供试条件中，pH对TC-1四环素降解效果的影响尤为显著。四环素在过酸或过碱的条件下易发生异构化和差向化。有研究表明，在酸性较强的溶液中，四环素因6位上的叔羟基易脱落，在5a-6位上形成双键，由于这个新双键的影响，C11、C11a和C12上的双键发生转移，形成C环芳构化；而在碱性溶液中，四环素C环打开，会转变成无活性的异构化合物[20-21]。可能上述影响，在不同初始pH的培养基中的四环素降解率显著高于对照，因为在实验过程中，作为降解率的计算依据，只检测培养基中四环素母体的含量，对于可能发生的差向化和异构化产物含量并未检测，所以使得各处理最终表现出的降解率由于包含pH的贡献而偏高。不同氮源处理中，尿素的添加虽不利于菌株的生长，但降解率却并未随之显著降低，这与尿素降解生成NH4+，使培养基pH迅速升高至10[13]，有利于四环素的非生物降解和尿素与四环素形成不溶性的复合物，降低了溶液中四环素母体的浓度有关[21]，该结果可为后续菌株堆肥及研制有机无机复混肥提供理论依据。孙凯等[22]在研究芘降解菌的特性时也发现，当培养基中的NaCl浓度高于一定程度时，降解菌的生长及降解率均受到显著影响，分析原因可能是培养基中NaCl浓度超过一定水平，菌株的细胞脱水，生长受到严重抑制，以致于难以正常有效地发挥降解作用，从而造成降解率显著降低。本研究结果与之一致。此外，TC-1的初始装液量为60%时，菌株生长受到一定程度的抑制，降解率也因此受到影响，表明TC-1属于好氧型菌株。有研究显示，微生物在好氧条件下更容易发挥对四环素的降解作用。许晓玲等[10]报道的降解菌随着装液量的增加，菌体的OD值下降，四环素的残留量上升。马志强等[11]研究无丙二酸柠檬酸杆菌的降解特性时也发现，当装液量从50 mL增加到200 mL时，四环素降解率降低约50%。

综上所述，本研究筛选到1株能以四环素作为唯一碳源生长的蜡状芽胞杆菌TC-1，对四环素的降解效率为56.2%，深入研究了该降解菌的降解特性，研究结果不仅丰富了现有的降解菌株资源库，也能为降解菌在后续堆肥化过程中的应用提供参考。

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Isolation, Identification and Characteristics of a Tetracycline-Degradation Bacterium

HUANG Jian-feng, ZHANG Fa-bao, PANG Yu-wan, HUANG Qiao-yi, TANG Shuan-hu

(Inst.ofAgric.Res. &Environ′t,GDAcad.ofAgric.Sci.KeyLab.ofPlantNutr′nandFert′rinS.Reg.GDKeyLab.ofNutr′nCycling&FarmlandConserv′n,Guangzhou510640)

The application of microorganism for tetracycline degradation possesses the advantages of economic efficiency and environment friendly, and has become a hot topic in current study. A selective media was adopted to isolate and screen the tetracycline-degradation bacteria. A strain TC-1 that could utilize tetracycline as unique carbon resource was isolated from chicken manure, it degradation tetracycline at the rate of 56.2% culturing for 7 d. This strain,named as TC-1,was identified initially asBacilluscereusaccording to the morphological features and the sequence analysis of 16S rRNA gene. Carbon and nitrogen sources combination, starting pH of medium, NaCl concentration and liquid filling volume four aspects were analyzed to study the tetracycline degradation performance of strain TC-1. The results showed that strain TC-1 grew the best in the medium with glucose and yeast as carbon and nitrogen sources,OD600was 2.17 after culturing for 7 d. However, the best degradation rate was observed in medium with sucrose and soy peptone as carbon and nitrogen sources combination that having the optimal degradation rate at 46.8%. Strain TC-1 grew the best in medium with pH 7 at the starting culture, theOD600and degrading rate were 0.44 and 92.3%, respectively. However, the growth of TC-1 was inhibited when NaCl concentration in the medium was at 15 g/L and the degradation rate of tetracycline was only 28.6%. When medium liquid filling volume was 40% the degradation rate of tetracycline was 56.2%.

tetracycline-degradation strain；isolation；identification；degradation rate; degradation feature

广东省科技计划项目(2015B020237007)

黄建凤 女，助理研究员，博士。主要从事农业微生物应用方面研究。

Tel：020-85161460，E-mail：hjf20051675@126.com

2016-03-26；

2016-04-19

Q93-331;X705

A

1005-7021(2017)01-0050-07

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.01.008

* 通讯作者。男，研究员，硕士。主要从事固体废弃物资源化研究。Tel：020-85161460，E-mail：fabaozhang@163.com