铁皮石斛黑斑病菌小分子毒素提取及产毒条件优化

［KH－3D］孔琼，袁盛勇，薛春丽，汪正红，李祥，卢丽蓉，明应忠

(红河学院生命科学与技术学院，云南省高校农作物优质高效栽培与安全控制重点实验室，云南蒙自661199)

铁皮石斛黑斑病菌小分子毒素提取及产毒条件优化

［KH－*3D］孔琼，袁盛勇*，薛春丽，汪正红，李祥，卢丽蓉，明应忠

(红河学院生命科学与技术学院，云南省高校农作物优质高效栽培与安全控制重点实验室，云南蒙自661199)

铁皮石斛是一种重要的中草药，随着人工种植面积的扩大和年限延长，铁皮石斛上的各种病害随之而来，其中由链格孢引起的石斛黑斑病日趋严重。本研究选取铁皮石斛黑斑病病原—细极链格孢为供试菌株，采用不同溶剂提取病原小分子毒素，同时对病原小分子毒素的产毒条件进行优化。结果表明，乙酸乙酯的萃取效果最好，且小分子毒素的活性成分主要存在于水相中;当培养基为PSK培养液，温度为25℃，转速为120 r/min，L∶D=12∶12的培养方式全振荡培养7 d时，该病原的小分子毒素活性最强。

铁皮石斛;黑斑病;小分子毒素

铁皮石斛(Dendrobium officinale)是一种重要的药用石斛，富含生物碱、多糖、氨基酸等，在抗肿瘤、降血糖及治疗白内障和肠胃疾病等具有良好疗效［1－3］。随着人们对其价值的不断认识和开发，中草药市场对铁皮石斛鲜条和干品的需求也不断增加，该药用植物已经由野生变为人工种植［4－5］。随着种植面积逐年扩大和年限延长，各种病害也随之而来，如炭疽病、疫病、黑斑病、茎基腐病、根腐病等均有发生［6］。据笔者2012年在屏边铁皮石斛种植基地田间调查，发现由链格孢引起的铁皮石斛黑斑病日趋严重，该病是栽培生产中常见的主要病害之一，全年均有发生，平均发病率在20%～50%，严重时可达到70%以上。

植物病原真菌导致寄主发病的主要因素是通过病原孢子或菌丝的机械压力侵入寄主;或于侵染过程中产生角质酶或细胞壁降解酶等分解植物组织并侵入;或病原物分泌产生的毒素等。其中毒素是植物病原代谢过程中产生的次生代谢产物，能在低浓度下干扰植物正常生理功能［7］，包括了大分子毒素和小分子毒素两类。大量研究表明，链格孢属真菌代谢产生的小分子毒素对寄主植物具有致病性，如细交链格孢酮酸、链格孢酚酸、链格孢酚及AAL-毒素等［8－10］，同时这些代谢产物还会残留于植物体内，人类食用后具有诱变和致癌作用［11］。因此关于铁皮石斛黑斑病病原及其致病机理和残留分析的研究迫在眉睫。

基于铁皮石斛种植生产实际出发，笔者于屏边铁皮石斛种植基地采集铁皮石斛黑斑病标样并进行室内分离鉴定为细极链格孢(Alternaria tenuissima)，前期研究发现该病原代谢产生的小分子毒素对铁皮石斛叶片具有致病性，因此本文章想探明小分子毒素提取的最佳有机溶剂，同时对产毒条件进行优化，为链格孢引起的铁皮石斛黑斑病致病机理和抗病品种选育提供理论依据。

1 材料与方法

1．1 材料及试剂

选取铁皮石斛黑斑病病原菌—细极链格孢(Alternaria tenuissima)(编号为SA2)为供试菌种;采用铁皮石斛组培苗(壮苗生根培养3个月)离体叶片进行毒素活性测定。试验中所用的丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲苯、正丁醇、乙醇等试剂均为分析纯购买于天津市风船化学试剂科技有限公司。液体培养基的配方为PD、Czapek、PSK、改良Fries和Richard培养液［12］。

1．2 方法

1．2．1 菌种培养将分离纯化后的供试菌于PCA固体培养基上于25℃，光周期为(L∶D=12∶12)培养6 d用于下列试验。

1．2．2 链格孢小分子毒素提取及毒素活性测定取直径为4 mm菌丝块接种于250 mL PSK液体培养基(每瓶接种3块)中，培养7 d(25℃，L∶D=12∶12，振荡120 r/min)后，用抽滤瓶获得滤液。在培养滤液中分别加入等体积具有不同极性的有机溶剂，并于磁力搅拌器上充分搅拌30 min，静止萃取直至分层后移出有机相，并对水相进行萃取，连续3次收集合并有机溶剂相，同时保留水相，并对两相进行减压蒸发［10］。然后将浓缩物复溶于无菌水中，稀释至5 mL后进行毒素活性测定。

毒素活性测定采用离体叶片针刺法进行，即用1 mL无菌注射器针刺伤铁皮石斛叶片，后将叶片置于无菌培养皿(含有无菌润湿的拱形滤纸)中，于伤口处滴加20 μl毒素溶液，于25℃光照培养箱中(L∶D=12∶12)培养，同时设置空白对照，每天观察症状表现，病斑于第5天观察和测量。

1．2．3 产毒条件优化取直径为4 mm菌丝块分别接种于PD、Czapek、PSK、改良Fries和Richard液体培养基中(每瓶250 mL培养液接3块，重复3次)，置于转速为120 r/min振荡培养箱中(25℃，L∶D=12∶12)培养7 d，通过抽滤瓶抽滤后获得无菌滤液，然后加入与滤液等体积的最佳提取试剂(1．2．2中得到的结果)进行萃取，方法见1．2．2。根据毒素的活性强弱(病斑大小)，筛选出最佳培养液。

培养时间筛选:采用最佳的液体培养基进行培养，设置为5、7、10、15、20、25 d时间梯度，置于转速为120 r/min、温度为25℃，光照为L∶D=12∶12的振荡培养箱上进行培养，并对培养液提取小分子毒素，测定其毒性的强弱。

培养温度筛选:根据上述获得的最佳液体培养基和培养时间，设置不同梯度温度(15、20、25、30、35℃)，于转速为120 r/min、光照为L∶D=12∶12的振荡培养箱中培养，培养后分别提取小分子毒素，同时称菌丝干重，并测定毒素活性强弱。

表1 不同有机溶剂萃取物的外观性状及生物活性Table 1Biological activities and appearance characters of extracts from different organic solvents

2 结果与分析

2．1 不同溶剂提取物外观性状及活性

细极链格孢的滤液用甲苯、氯仿、正丁醇、乙酸乙酯、丙酮有机溶剂进行小分子毒素萃取，不同溶剂其萃取分层速度不同，其毒性差异较大，具体见表1。根据萃取后液体的分层速度快慢分为分层快和分层慢，一般分层时间﹤5 min为分层快，而﹥25 min为分层慢。通过对提取后有机相和水相的毒素活性比较，发现5种有机溶剂提取物中活性物质主要存在于水相;其中丙酮与乙酸乙酯的萃取效果最佳，且二者处理后的毒素活性差异不大;其次是氯仿和正丁醇;甲苯提取效果最差。但由于丙酮易挥发，不分层，因此最佳的提取溶剂为乙酸乙酯。

2．2 产毒条件优化

2．2．1 培养基筛选在供试5种培养液中，经PSK培养液培养的小分子毒素活性最强(表2)，其病斑最大显著高于其他处理(P＜0．05)，此时菌丝干重增长量也达最大;其次为Richard、PD及Czapek培养液的处理，但三者间差异不显著;毒素活性最小的培养液为改良Fries，菌丝干重最小，显著低于其他处理(P＜0．05)。因此，细极链格孢小分子毒素活性的最佳培养液为PSK培养液。

表2 不同培养液对细极链格孢小分子毒素活性及菌丝生长的影响Table 2Effect of different liquids on pathogenic activity of small molecule toxins and mycelial growth of Alternaria tenuissima

2．2．2 培养时间筛选选用最佳培养液，在不同培养时间下，铁皮石斛黑斑病病原菌丝生长量和毒素活性存在较大差异，病原菌的小分子毒素活性随着培养时间的延长先升后降，具体见表3。在6个培养时间下，当菌丝块振荡培养7 d时，小分子毒素活性最强，病斑最大极显著高于其它处理(P＜0．01);其次是10 d处理后的毒素，病斑为(3．13±0．09) mm显著高于其他处理，此时菌丝生长量适中。因此，细极链格孢小分子毒素的最佳培养时间为7 d。2．2．3培养温度筛选采用上述筛选出的最佳培养条件，5种温度处理后的细极链格孢小分子毒素都有一定活性，其致病所形成的病斑大小存在显著差异(表4)。其中25℃培养下，病原菌产生的小分子毒素活性最强，病斑最大为(4．07±0．12)mm，极显著高于其它处理(P＜0．01)，此时菌丝干重也达到最大，菌丝干重为(14．00±0．58)mg。而在15℃时病斑最小，菌丝干重最小，但与35℃处理的差异不显著，说明温度过高或过低都不利于细极链格孢小分子毒素的生成和菌丝生长。因此，病原菌的最佳产毒温度为25℃。

表3 培养时间对细极链格孢小分子毒素活性及菌丝干重的影响Table 3Effect of cultural times on pathogenic activity of small molecule toxins and dry weight of hypha of Alternaria tenuissima

3 讨论

研究发现不同有机溶剂提取后的植物病原真菌小分子毒素活性存在较大差异，萃取效果与有机溶剂的极性强弱有关，极性弱的有机溶剂萃取效果差，如甲苯、氯仿(两者的介电常数e＜4．8)等;而极性强的有机溶剂萃取效果好，如正丁醇(e=17．5)、乙酸乙酯(e=6)、丙酮(e=20．7)等，且致病成分主要存在于水相中［10］。文章的研究结论与前人的结果相一致，且铁皮石斛细极链格孢小分子毒素的提取最佳有机溶剂是乙酸乙酯，同时该种试剂也适合于链格孢菌(Alternaria alternata)毒素提取［14－15］。

表4 培养温度对细极链格孢小分子毒素活性及菌丝干重的影响Table 4Effect of cultural temperatures on pathogenic activity of small molecule toxins and dry weight of hypha of Alternaria tenuissima

大量研究表明，植物病原真菌体外代谢产生的毒素量及活性强弱受供试菌株、培养基成分和外界环境条件的影响较大。本研究中发现铁皮石斛黑斑病病原细极链格孢在PSK液体培养基中菌丝生长量和产毒素均显著高于其他4种液体培养基，这与红豆草黑腐病菌(Alternaria tenuissima)［9］和紫茎泽兰链格孢菌(Alternaria alternata)［16］产毒的最适培养基相一致。其次适合产毒的培养温度为25℃，相同的结果也在百日草链格孢菌(Alternaria zinniae)［17］的产毒培养中发现;但红豆草黑腐病菌其菌丝生长和产毒的最佳温度不一致，高温(25℃)有利于菌丝的生长，而低温(15℃)有利于毒素的产生［12］。同时培养时间的长短也会影响产毒的效果，本试验中适合铁皮石斛黑斑病菌(Alternaria tenuissima)产毒的培养时间为7 d，而小麦黑胚病菌(Alternaria alternata)产毒的最佳培养时间为13～15 d［18］，红豆草黑腐病菌为13 d［12］。

本试验研究结果与前人研究结果存在着一定的差异，这可能是由于菌种或寄主植物不同造成的。因此有必要对不同地理分布或致病性差异较大的分离菌进行生物学特性研究，这不仅是铁皮石斛进行抗黑斑病的抗性材料鉴定的基础，也是研究病原菌致病机理的基础，可以弄清该菌是否存在生理小种。

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(责任编辑 王家银)

Extraction and Cultural Optimization of Small Molecule Toxins of Pathogen Causing Black Spot Disease from Dendrobium officinale

KONG Qiong，YUAN Sheng-yong*，XUE Chun-li，WANG Zheng-hong，LI Xiang，LU Li-rong，MING Ying-zhong
(College of Life Science and Technology，Key Laboratory of High Quality and Efficient Cultivation and Security Control of Crops for Yunnan Province，Honghe University，Yunnan Mengzi 661199，China)

Dendrobium officinale was a precious traditional Chinese herb．The various diseases affected growth of Dendrobium officinale with growing areas and ages，of which the black spot disease caused by Alternaria tenuissima was more and more serious．The extraction reagents and production conditions of small molecular toxins of A．tenuissima in black spot disease were studied in this paper．The results showed that the best extraction reagents was ethyl acetate，and the active ingredient of toxin was mainly in aqueous phase，the optimal cultural conditions were PSK liquid medium，25℃，7 day in 120 r/min with photoperiods of L∶D=12∶12，respectively．

Dendrobium officinale;Black spot disease;Small molecule toxins

S567

A

1001－4829(2017)1－0118－04

10．16213/j．cnki．scjas．2017．1．021

2015－03－15

红河学院校级委托项目(13WT001);红河学院博士启动项目(14bs14);红河学院大学生科技创新基金(SZ1319);红河学院大学生创新创业训练计划项目(DCXL1305);红河学院硕士点植物保护一级学科建设项目

孔琼(1976－)女，云南宣威人，副教授，博士，从事植物病理学研究，E-mail:kq_biology2@126．com，*为通讯作者，E-mail:ysy9069@163．com。