新疆油鸡H9N2亚型禽流感病毒PB1基因的克隆与序列分析

［KH－*D］武军元，黄忠武，康强，姚礼文

(1．塔里木大学，新疆阿拉尔843300;2．新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆阿拉尔843300;3．新疆库车县动物疾病预防控制中心，新疆库车842000;4．阿克苏地区动物疫病控制诊断中心，新疆阿克苏843000;5．新疆阿瓦提县畜禽改良站，新疆阿瓦提843200)

新疆油鸡H9N2亚型禽流感病毒PB1基因的克隆与序列分析

［KH－*3D］武军元1，2，黄忠武3，康强4，姚礼文5

(1．塔里木大学，新疆阿拉尔843300;2．新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆阿拉尔843300;3．新疆库车县动物疾病预防控制中心，新疆库车842000;4．阿克苏地区动物疫病控制诊断中心，新疆阿克苏843000;5．新疆阿瓦提县畜禽改良站，新疆阿瓦提843200)

为了阐明新疆油鸡H9亚型流感病毒PB1基因的分子特征与进化趋势，本研究采用RT-PCR技术对新疆油鸡分离株A/ Chicken/XinjiangBaicheng/1/2014(H9N2)的PB1基因进行了克隆、测序及分子进化分析，将PB1基因的核苷酸序列和对应的氨基酸序列与Genbank中已经公布的参考序列进行同源性比较。结果表明，新疆油鸡分离株的PB1基因由2274个碱基组成，编码757个氨基酸，与AIV A/chicken/Henan/89/2013(H7N9)的PB1基因处于同一分支，其核苷酸和氨基酸水平的同源性依次为99．2%和99．4%，新疆油鸡分离株的PB1基因不属于欧亚分支G1、A/CK/BJ/94和Y439的任何谱系。

流感病毒;油鸡;聚合酶PB1基因;克隆;序列分析

A型流感病毒是威胁人类健康的重要病原体之一，根据其表面蛋白血凝素(Hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)的不同，可以将其分为多种血清型。流感病毒的8个基因片段分别编码11种不同的蛋白质，RNA聚合酶是由流感病毒基因组3个最大的片段PB1、PB2和PA编码的异源三聚体复合物，其中，PB1是病毒RNA聚合酶的催化亚基，负责病毒RNA的复制以及转录［1］。在流感病毒的重配中，PB1蛋白及病毒表面糖蛋白经常发生重排，这种重排能通过提高流感病毒的适应性而成为感染动物乃至人类的优势毒株［2］。20世纪，导致人类4次流感大流行的病毒株中有2次是因PB1基因来自于禽类而形成重排病毒引起［3］，因此，禽源流感病毒PB1基因的进化趋势在流感病毒的分子流行病学研究中具有重要的作用。本研究对从新疆油鸡当中分离到的1株H9N2亚型禽流感病毒的PB1基因进行了克隆测序及分子进化分析，以了解新疆油鸡H9N2亚型AIV PB1基因的遗传进化情况。

1 材料与方法

1．1 供试材料

1．1．1 病毒H9N2亚型禽流感病毒新疆油鸡分离株A/Chicken/XinjiangBaicheng/1/2014(H9N2) (简称Xj14)于新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室分离保存。

1．1．2 主要试剂及仪器设备High Pure Viral RNA Kit(Cat．No．11858882001)购自Roche公司、PrimeScriptTMII First-strand cDNA Synthesis Kit(Cat．No:6210A)购自宝生物工程(大连)有限公司、HiPure Gel Pure DNA Kits购自Magen公司、pGEM-T Easy Vector购自Promega公司、Trans 2K DNA Markers，Trans Taq-T DNA Polymerase购自北京全式金生物技术有限公司、TIANprep Mini Plasmid Kit购自天根生化科技有限公司。梯度PCR仪、全自动凝胶成像分析系统、高速离心机为德国Eppendorf公司。

1．2 试验方法

1．2．1 引物设计参照已知的AIV序列设计了1条反转录通用引物Uni 12，用于AIV各片段的反转录扩增，序列如下:Uni 12:5'-AGCAAAAGCAGG-3'。

参考NCBI公布的H9N2亚型AIV的PB1基因序列，利用Primer premier 5．0软件设计一对基因特异性引物，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，序列如下:Bm-PB1-1:5'-TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGCA-3';Bm-PB1-2:5'-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGCATTT-3'。

1．2．2 病毒RNA提取及PB1基因RT-PCR扩增取200 μl尿囊液，按照Roche公司的High Pure Viral RNA Kit(Cat．No．11858882001)说明书提取病毒RNA，用流感病毒反转录通用引物Uni-12，按照PrimeScriptTMII First-strand cDNA Synthesis Kit(Cat．No:6210A)说明书反转录合成cDNA。用所设计的PB1的基因特异性引物进行PCR扩增，采用50 μl的反应体系，组成如下:10×PCR缓冲液5 μl，10 mM dNTPs 4 μl，Taq DNA聚合酶(5 U)0．5 μl，上下游引物各1 μl(10 μM)，cDNA模板1 μl，无RNA酶的水37．5 μl。反应条件:95℃，5 min;随后进行如下35个循环:95℃40 s，53℃40 s，72℃3．5 min;最后一个循环结束时72℃10 min。PCR反应结束后，取5 μl反应产物在1．2%琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下观察结果。

1．2．3 PB1基因克隆与序列测定参照HiPure Gel Pure DNA Kits说明书将RT-PCR产物纯化回收，回收产物克隆到pGEM-T Easy Vector上，将连接产物转化DH5a感受态细胞，选择PCR鉴定为阳性的重组质粒送北京擎科武汉测序部进行序列测定。

1．2．4 PB1基因进化生物学分析应用序列分析软件DNAStar对测序结果进行拼接处理，将所得序列与GenBank中公布的H9N2亚型流感病毒典型代表株(表1)的PB1基因序列进行同源性比较，用MEGA6软件的neighbour-joining方法构建进化树，分析其遗传进化关系。

表1 同源性分析的参考毒株Table 1Reference strains used in nucleotide sequence identity analysis

2 结果与分析

2．1 PB1基因的RT-PCR扩增

利用设计针对PB1基因的特异性引物Bm-PB1-1/Bm-PB1-2进行PCR，扩增产物经1．2%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，分离株PB1基因在2300 bp左右有一条特异条带，与预期大小一致(图1)。

2．2 PB1基因的核苷酸及氨基酸序列同源性分析

测序结果表明，本研究扩增的PB1基因开放阅读框由2274个碱基组成，编码757个氨基酸，将扩增的核酸序列提交NCBI数据库获得GenBank登录号KX602186。将本研究分离毒株与GenBank公布的其它毒株进行核苷酸和氨基酸序列同源性比较，结果发现，本研究分离毒株的核苷酸和氨基酸序列均与A/chicken/Henan/89/2013(H7N9)具有较高的同源性，其核苷酸和氨基酸水平的同源性依次为99．2%和99．4(表2)。

图1 PB1基因的RT-PCR扩增Fig．1RT-PCR amplification of PB1 gene

表2 分离毒株与参考毒株PB1基因核苷酸和氨基酸同源性比较Table 2Homology of PB1 genes of isolated strain and reference strains(%)

2．3 PB1基因的系统进化分析

将本研究分离毒株与国内流行毒株的PB1基因进行多序列比对并绘制系统发育进化树(图2)，分离毒株Xj14的PB1基因与国内参考毒株A/ chicken/Henan/89/2013(H7N9)的亲缘关系最近。

图2 PB1基因系统进化树Fig．2Phylogenetic tree based on PB1 gene

3 讨论

禽流感(Avian influenza，AI)是由A型流感病毒(Avian influenza virus，AIV)引起的病毒性传染病，血清亚型众多，遗传变异程度极其频繁，中国1994年首次从广东省的发病鸡群中分离到H9N2亚型禽流感病毒［4－5］，1998年我国首先报道H9N2亚型AIV可以感染人［6］，1999年中国香港地区发生了人感染H9N2的病例［7］。进一步研究表明，1997年中国香港地区感染人的H5N1病毒的内部蛋白基因片段来源于H9N2亚型AIV［8］，2013年发生于中国上海等地的重配病毒H7N9其6个内部基因均来自H9N2亚型AIV［9］，刘金华［10］等近期发表在PNAS的研究揭示单一基因型H9N2流感病毒在我国鸡群中的优势流行为H7N9流感病毒的重排提供了充分条件。由此可见，H9N2流感病毒可以通过基因重组或重配产生新的对哺乳动物甚至人类高致病力的病毒株，因此，加强对H9N2亚型AIV的检测，密切关注其重配情况，进一步对其生物学特性以及分子流行病学研究，对于预测和防控流感大流行的发生具有不可忽视的作用。

禽流感病毒依据HA和NA基因的分子进化特征可以分为北美和欧亚两大谱系，欧亚谱系又进一步分为A/CK/BJ/94、G1/97和Y439/97 3个亚分支［11］，AIV的HA、NA、NP、M、PB1、PB2和PA进化情况相似。本室前期的研究结果显示新疆油鸡分离株Xj14的HA和NA基因均属于国内稳定存在的BJ/94亚分支，且从分子水平上证实Xj14为低致病力的毒株，只是HA在关键位点出现Q234L的突变，NA基因在3个红细胞吸附区域发生多处突变，HA和NA基因的糖基化位点均有所增加，这种受体结合位点的改变和潜在糖基化位点的增加可能使之在进化过程中获得跨种传播的能力［12］。本研究发现，新疆油鸡分离毒株Xj14的PB1基因与2013年家禽中分离的A/chicken/Henan/89/2013(H7N9)具有高度同源性，遗传进化处于同一分支，而与国内流行的欧亚谱系分支A/CK/BJ/94、G1/97和Y439/97均不处在相同的分支，遗传进化距离较远。以往认为，H7亚型流感病毒只在禽类中流行，2013年2月底，我国东部省市地区首次陆续发现了H7N9甲型禽流感病毒感染人的病例［13］，进一步研究表明，H7N9亚型流感病毒能够发生人与人之间的感染［14］。新疆油鸡分离株Xj14是欧亚谱系以及来自欧亚谱系之外的不同病毒重排的新毒株，其内部基因片段PB1与目前感染人的H7N9亚型流感病毒遗传距离最接近，这一进化趋势很有可能是本研究分离毒株获得致病性的主要原因。

综上所述，应当加强边疆新疆地区H9N2亚型AIV监控的力度，慎防重排的H9N2亚型致病毒株感染人群。

［1］Li M L，Rao P，Krug R．The active sites of the influenza capdependent endonuclease are one different polymerase subunits［J］．EMBO J， 2001，20:2078－2086．

［2］Gíria M，de Andrade H．Genetic evolution of PB1 in the zoonotic transmission of influenza A(H1)virus［J］．Infect Genet Evol，2014，27:234－243．

［3］Kawaoka Y，Krauss S，Webster R G．Avian-to-human transmission of the PB1 gene of influenza A viruses in the 1957 and 1968 pandemics［J］．J Virol，1989，63:4603－4608．

［4］Wang J Y，Ren J J，Liu W H，et al．Complete genome sequence of a new H9N2 avian influenza virus isolated in China［J］．Genome Announc，2013，1(3):eoo261－13．

［5］陈伯伦，张泽纪，陈伟斌．禽流感研究I．鸡A型禽流感病毒的分离与血清学初步鉴定［J］．中国兽医杂志，1994(10):3－5．

［6］Guo Yuan-ji，Li Jian-guo，Cheng Xiao-wen．Discovery of humans infected by avian influenza A(H9N2)virus［J］．Chin J Exp Clin Virol，1999，15:105－108．

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［9］Gao R，Cao B，Hu Y，et al．Human influenza with a novel avian-origin influenza A(H7N9)virus［J］．N Engal J Med，2013，368(20):1888－1897．

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［14］Koopmans M，de Jong M D．Avian influenza A H7N9 in Zhejiang，China［J］．Lancet，2013，381(9881):1882－1883．

(责任编辑 陈虹)

Cloning and Sequence Analysis of PB1 Gene of H9N2 Subtype Avian Influenza Viruses Isolated from Xinjiang Soy Sauce Chicken

WU Jun-yuan1，2，HUANG Zhong-wu3，KANG Qiang4，YAO Li-wen5
(1．Tarim University，Alar，Xinjiang 843300，China;2．Key Laboratory of Tarim Animal Husbandry Science and Technology of Xinjiang Production＆Construction Corps，Xinjiang Alar 843300，China;3．Animal Centers for Disease Control and Prevention of Kuche County，Kuche，Xinjiang 842000，China;4．Animal Centers for Disease Control and Prevention of Aksu，Xinjiang Aksu 843000，China;5．Animal Hatchery of Awati County，Xinjiang Awati 843200，China)

In this study，the PB1 gene of H9N2 subtype avian influenza viruses isolated from Xinjiang soy sauce chicken was amplified by RT-PCR，and molecular characteristics were analyzed to reveal the evolutionary trend of PB1 genes．The homology of nucleotide sequences and putative amino acid sequences were compared with several reference strains．The result showed that the cDNA contains whole open reading frame of PB1 gene，2274 nucleotide，coding 757 amino acides．The PB1 gene isolated strain was on the same branch with A/chicken/ Henan/89/2013(H7N9)，the nucleotide and amino acids homologies of PB1 gene between isolated strain and A/chicken/Henan/89/2013 (H7N9)were 99．2%and 99．4%，and the isolated strain belong to none of the branch G1，A/CK/BJ/94 and Y439 of Eurasian lineage．

Influenza viruse;Soy sauce chicken;PB1 polymerase gene;Clone;Sequence analysis

S852．65

A

1001－4829(2017)1－0222－04

10．16213/j．cnki．scjas．2017．1．038

2016－07－27

国家自然科学基金(31160513)

武军元(1980－)，男，副教授，博士，从事预防兽医学教学与科研工作，*为通讯作者，E-mail:wjyn-w@126。