长期继代下玉米愈伤组织差异蛋白的双向电泳分析

［KH－*3D］付小康，常纪苹，宋蕊芳，邢小龙，胡德升，胡彦民*，钟立华

(1．河南农业大学农学院，河南郑州450002;2．云南农业大学资源与环境学院，云南昆明650201)

长期继代下玉米愈伤组织差异蛋白的双向电泳分析

［KH－*3D］付小康1，常纪苹1，宋蕊芳2，邢小龙1，胡德升1，胡彦民1*，钟立华1

(1．河南农业大学农学院，河南郑州450002;2．云南农业大学资源与环境学院，云南昆明650201)

实验以玉米自交系齐319幼胚进行愈伤组织的诱导及继代培养，提取继代5次和10次的胚性愈伤组织中可溶性蛋白质进行双向电泳。运用2-D凝胶图像分析软件PDQuest进行分析，探究玉米胚性愈伤组织长期继代培养的分子调控机理。结果表明，长期继代10次相比5次共有20个有明显差异的蛋白点，其中14个表达下调，6个表达上调。通过质谱分析及搜索数据库鉴定出14-3-3-like protein GF14-12和ferritin-1，chloroplastic 2个蛋白，可能是愈伤组织长期继代后细胞生长代谢途径受到影响的结果。

玉米;愈伤组织;继代培养;双向电泳;质谱分析

建立良好的玉米组织培养体系对玉米转基因及细胞遗传学的研究十分重要［1－4］。自1975年GREEN等［5］用玉米幼胚作为外植体获得再生植株以来，玉米组织培养体系得到不断完善，使得以此为基础的突变体筛选、转基因等技术得到广泛应用，同时也节省了大量供体材料和人力。但大量研究［6－10］表明，在长期继代培养的过程中，随着胚性愈伤组织继代次数的增加生长会受到抑制，例如生长量降低、再生率差等，成为制约玉米组织培养研究的关键因素。关于玉米愈伤组织继代培养的影响因素已有很多研究，但在蛋白质水平上还鲜有报道。因此，研究胚性愈伤组织长期继代过程中的蛋白质分子表达机理，对探索玉米组织培养体系的研究具有很重要意义。玉米齐319是进行愈伤组织继代培养广泛应用的良好材料。本实验通过蛋白双向电泳和质谱分析技术，探究玉米愈伤组织齐319在不同继代次数的蛋白差异，为愈伤组织长期继代机理的研究在分子水平上提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1．1 供试材料

玉米自交系齐319。

1．2 实验方法

1．2．1 材料准备挑选籽粒饱满且生活力强的齐319种子种植于河南农业大学郑州科教园区，取12d左右的幼穗(取幼胚大小为1～2 mm)，在超净工作台上用70%的酒精浸泡10 min进行表面消毒，用高温灭菌的手术刀片取出幼胚，并使其盾片朝上，放置于诱导培养基中，在26℃的组织培养室中暗培养，待形成为胚性愈伤后，转接到继代培养基中。幼胚愈伤组织每培养15 d为一个继代周期，筛选胚性愈伤组织，继代到新培养基中。所有培养条件均为26℃暗培养。在继代5和10次时，用灭菌镊子随机、均匀取培养基中的胚性愈伤组织，冷藏于－80℃备用。

1．2．2 蛋白样品的制备取2 g玉米愈伤组织样品，研钵中充分研磨，①加入20 mL预冷的酚抽提提取液［1%十二烷基硫酸钠(SDS)，0．1 M pH 8．8 Tris-HCl，10 mM二硫苏糖醇(DTT)］;②15 000 r/ min、4℃离心10 min，取上清;③加入等体积平衡酚，摇匀30 min;④12 000 r/min离心5 min，取酚层，按1∶5的体积加0．1 M乙酸铵/甲醇，混匀，－20℃、30 min;⑤15 000 r/min、4℃离心5 min，得沉淀;⑥加入预冷的80%丙酮(0．07%β-巯基乙醇)，混匀，－20℃1 h，16 000 r/min、4℃离心15 min，得沉淀;⑦重复步骤⑥并过夜，最后以纯丙酮代替80%丙酮;最后所得沉淀进行冷冻干燥;⑧取适量干燥的样品粉末，按20 μl/mg的比例加入裂解液［8M尿素(urea)、2 M硫脲(thiourea)、4%两性电解质(CHAPS)、2．5 μl Bio-lyte、40 mM二硫苏糖醇(DTT)］，28℃水浴锅中水浴溶解(不高于30℃)，并震荡;⑨16 000 r/min、25℃离心40 min，取上清;⑩参照Bradford法［11］，以牛血清蛋白为标准蛋白测定蛋白浓度。

1．2．3 双向电泳玉米愈伤组织可溶性蛋白质的双向电泳参照O’Farrell等［12］的方法，采用24 cm p H4～7的胶条进行水化，上样体积450 μl，蛋白量800 μg。第一向等电聚焦36 h。S1水化，50 V→12 h;S2除盐，200 V→1 h;S3除盐，500 V→1 h;S4升压，1000 V→0．5 h;S5升压，5000 V→0．5 h;S6升压，10 000 V→1 h;S7聚焦，10 000 V→10 h;S8保存，500 V→12 h。经2次平衡后，转第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用12%的分离胶及含溴酚蓝的低熔点琼脂糖作封胶液。凝胶使用改良考马斯亮蓝染色法(modified Coomassie brilliant blue，mCBB)染色［固定液(40%乙醇，10%乙酸)，固定1 h，染色液(0．12%CBB G250、10%硫酸铵、10%磷酸、20%乙醇)，染色l d。洗脱液为10%乙酸，经3～4次换水至背景清晰即可进行图像扫描。

1．2．4 凝胶扫描与图像分析染色后的凝胶使用alpha凝胶成像系统扫描获取图像，用PDQuest分析软件对图像进行背景消减，蛋白点的检测及匹配等，并手动删除假点及不理想的点。以vol%为标准，将差异显著点认为是大于1．5倍以上的点。

1．2．5 差异蛋白质MALDI-TOF-MS鉴定及数据库对比将检测到的差异蛋白点切下并分装于1．5 mL离心管中，记录对应的序列编号;送中国科学院上海生命科学研究院蛋白质组研究分析中心进行蛋白点的MALDI-TOF-MS鉴定，并在NCBInr玉米数据库中比对分析。

2 结果与分析

2．1 蛋白双向电泳改进

本实验参照金德善等［13］对雪莲愈伤蛋白质的酚法提取的基础上，使80%冷丙酮沉淀蛋白过夜并高速离心，并在加入Tris饱和酚后增加室温的震荡时间到30 min，使蛋白质与酚充分融合，更大程度去除蛋白样品中杂质、融于酚内，提高蛋白提取效率。保持其他参数不变，对提取后的蛋白进行600和800 μg 2种上样量的蛋白2-D胶图(图1)进行比较。通过对2-D胶图分析比较可以看发现，800 μg的图像(图1-b)背景清晰，条纹数量减少，蛋白点清而明显。600 μg(图1-a)背景较模糊蛋白点不易分开。

图1 600、800μg 2种上样量的2-DE图谱比较Fig．1Comparison of 2-DE maps of 600 and 800 μg sample amounts

2．2 不同继代次数处理的双向电泳分析

使用PDQuest分析软件对玉米自交系齐319继代5次(图2-a)和10次(图2-b)的愈伤组织进行双向电泳2-D胶图分析，以差异大于1．5倍的蛋白点为显著差异点，共识别20个酸性差异蛋白。随着继代时间变长，有14个表达下调，6个表达上调。

2．3 差异蛋白点的MALDI-TOF-MS鉴定

选取10个丰度较高的差异蛋白点进行质谱鉴定，鉴定出2个阳性结果，分别为14-3-3-like protein GF14-12和ferritin-1，chloroplastic 2个蛋白(表1)。

图2 玉米愈伤组织蛋白双向电泳图Fig．2Two-dimensional gel electrophoresis of maize callus proteins

表1 继代不同次数下玉米愈伤组织差异蛋白质谱鉴定Table 1Identificationof differentially expressed proteins of maize callus by MALDI-TOF-MS under callus subculture

3 结论与讨论

3．1 双向电泳方法的改进

双向电泳中样品制备是影响蛋白差异组学分析的关键因素之一，由于玉米愈伤组织在培养基中长期培养，积累的酚，糖及次生代谢物较多，直接影响蛋白样品的提取质量。根据金德善等［13］对雪莲愈伤蛋白提取方法的研究，酚法较其他2种TCA-丙酮法和尿素法更好，本实验采用酚法提取愈伤蛋白。雷震等［14］认为80%冷丙酮过夜沉淀过夜并高速离心可以更好地去除盐类，因此蛋白在提取时由5500 r/min提高到15 000 r/min，并增加Tris饱和酚室温的震荡时间。上样量的大小一直是双向电泳分析中一直探索的问题［15－16］，本实验采用600和800 μg 2种上样量，结果表明上样量为800 μg时2-D图像更加清晰，适用于玉米愈伤蛋白进行双向电泳分析，能够更好的满足实验要求。

3．2 长期继代下蛋白的差异表达

邓士政等［17］研究证实，玉米愈伤组织长期培育的的过程中存在愈伤组织质量变劣，再生能力下降等问题，愈伤组织生长量、胚性愈伤组织比率和愈伤组织幼苗再生率等随着继代次数的增加呈下降趋势。已有研究表明［18－19］，玉米愈伤组织在长期的培养过程中与氮代谢有很大关系，随着继代时间的延长，愈伤组织细胞内的氮代谢发生变化，积累大量含氮的有害化合物，是影响愈伤组织培养的重要因素。长期继代产生的有害化合物，抑制细胞生长代谢，细胞生长量及再生率降低。有研究表明［19－20］，14-3-3蛋白在植物激素调控、生长发育及营养代谢调控等过程中有很重要的作用，并指出其在氮代谢途径中起到关键作用。Lambek等［21］研究拟南芥不同Ca2+依赖型蛋白激酶(CPKS)中发现，在CPK-17作用下硝酸还原酶(NP)Ser534磷酸化，14-3-3蛋白结合磷酸化后的硝酸还原酶(NR)而失去活性，进而调节细胞体内含氮化合物的含量，以维持正常生长代谢。

本研究中鉴定的14-3-3-like protein GF14-12与14-3-3蛋白通过同源BLAST具有相同的保守结构域(覆盖率为100%，相似度为99%)，认为14-3-3-like protein GF14-12表达下调可能与愈伤组织长期继代后氮代谢途径失衡有直接关系。长期继代培养，体内含氮有害化合物的积累造成正常的细胞氮代谢失去平衡，影响正常生长代谢，愈伤组织生长量降低，愈伤组织细胞可溶性蛋白呈下降的表达趋势。ferritin-1，chloroplastic蛋白在叶绿素的合成，愈伤组织再生中有很重要的作用，愈伤组织再生率下降可能也是由于长期继代导致氮代谢途径受阻该蛋白表达量下调的结果，这与Asuka Nishimura等［22］在水稻中研究的愈伤组织再生与氮代谢途径有关相吻合。玉米愈伤组织在长期继代过程中可能也伴随有应激性蛋白和其他抗性蛋白的差异表达，这也是要进行下一步研究的要点。

［1］WAN Y，WIDHOLM J M，LEMAUX P G．Type I callus as a bombardment target for generating fertile transgenic maize(Zea mays L．)［J］．Planta，1995，196:23－27．

［2］韦小敏，白静，季良越，等．玉米耐盐愈伤组织变异体筛选体系的建立［J］．河北农业大学学报，2007，30(3):14－17，35．

［3］Deng S，Dong Z，Zhan K，et al．Moderate desiccation dramatically improves shoot regeneration from maize(Zea mays L．)callus［J］．In Vitro Cellular＆Developmental Biology-Plant，2009，45(1):99－103．

［4］张莹莹，吴连成，张赛赛，等．农杆菌介导的玉米愈伤组织遗传转化影响因子和植株再生条件［J］．江苏农业科学，2014(11):51－53，54．

［5］GREEN C E，RHODES C A．Plant regeneration from tissue cultures of maize［J］．Crop Sci，1975，15:417－421．

［6］ASANO Y，ITo Y，0HARA M，SUGUIRA K，et al．Improved plant regeneration response of creeping bent grass and japonica rice by maltose and lactose［J］．Plant Cell Tissue Organ Cult，1994，39: 101－103．

［7］BINH D Q，HESZKY L E．Restoration of the regeneration potential of long-term cell culture in rice(Oryza satina L．)by salt pretreatment［J］．J Plant Physio1，1990，36:336－340．

［8］KAVIKISHOR P B，REDDY G M．Regeneration of plants from longterm cultures of Oryza sativa L．［J］．Plant Cell Rep，1986(5):391－393．

［9］VASIL I K．Developing cell and tissue culture systems for the improvement of cereal and glass crops［J］．Journal of Plant Physiology，1987，128:193－218．

［10］VASIL V，VASIL I K，LU C．Somatic embryogenesis in longterm callus cultures of Zea mays L．(Gramineae)［J］．Am J Bot，1984，71:389－394，158－161．

［11］Bradford M M．A rapid and sensitive for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding［J］．Anal．Biochem．，1976，72:248－254．

［12］O’Farrell P H．High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins［J］．J．Biol．Chem．，1975，250:4007－4021．

［13］金德善，卢存福，兰小中，等．雪莲愈伤组织蛋白质提取及双向电泳分析［J］．西北植物学报，2012，32(9):1903－1909．

［15］周雪梅，袁坤，杨礼富，等．蛋白纯化方法和上样量对玉米叶片蛋白双向电泳图谱的影响［J］．热带农业科学，2013，33(4): 36－38．

［16］曹君迈，张欣．甘草愈伤组织蛋白质组双向电泳技术的建立［J］．干旱地区农业研究，2015(3):153－158．

［17］邓士政，董中东，刘桂珍，等．长期继代培育对玉米幼胚愈伤组织的影响［J］．安徽农业科学，2014，32:11236－11237．

［18］Ogawa T，Fukuoka H，Yano H，et al．Relationships between nitrite reductase activity and genotype-dependent callus growth in rice cell cultures［J］．Plant Cell Reports，1999，18(7－8):576－581．

［19］秦文娟．玉米幼胚培养系统优化及硝态氮代谢与幼胚培养关系的研究［D］．河南农业大学，2009．

［20］周颖，李冰樱，李学宝，等．14-3-3蛋白对植物发育的调控作用［J］．植物学报，2012，47(1):55－64．

［21］Aitken A．14-3-3 proteins:a historic overview［J］．Seminars in Cancer Biology，2006，16(3):162－72．

［22］Iris L，Jen-Chih C，Sabina K，et al．Kinetic analysis of 14-3-3-inhibited Arabidopsis thaliana nitrate reductase［J］．Biochemistry，2010，49(37):8177－8186．

［23］Asuka N，Motoyuki A，Shaoyang L，et al．Isolation of a rice regeneration quantitative trait loci gene and its application to transformation systems［J］．Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2005，102(33):11940－11944．

(责任编辑 陈虹)

Analysis of Soluble Maize Callus Proteins under Long-term Subculture by Two-dimensional Electrophoresis

FU Xiao-kang1，CHANG Ji-ping1，SONG Rui-fang2，XING Xiao-long1，HU De-sheng1，HU Yan-min1*，ZHONG Li-hua1
(1．College of Agronomy，Henan Agricultural University，Henan Zhengzhou 450002，China;2．College of Resources and Environmental Sciences，Yunnan Agricultural University，Yunnan Kunming 650201，China)

In this experiment，the tissue ofmaize(Zea mays L．)inbred lines Qi319 immature embryos wasinducted and subcultured to extracted embryonic callus soluble proteins five times and ten timesin two-dimensional electrophoresis，and its molecular regulation mechanism by Software PDQuest was analyzed．The result showed that under long-term subculture，there were 20 significant difference proteins in soluble maize callus protein，of which 14 was up-expressed spot and 6 down-expressed spots．MALDI-TOF-MS analysis indicated that there were 14-3-3-like protein GF14-12and ferritin-1，chloroplastic protein，which were considered as the results of the influence of the cell growth and metabolism pathway after long-term subculture of callus．

Maize;Tissue;Subculture;Two-dimensional gel electrophoresis;MALDI-TOF-MS

S513

A

1001－4829(2017)1－0011－04

10．16213/j．cnki．scjas．2017．1．003

2016－01－25

国家自然科学基金项目(31071431)

付小康(1990－)，男，河南安阳人，硕士研究生，从事玉米生物技术育种研究，E-mail:xkang_2010@163．com，Tel: 13213181841，*为通讯作者:胡彦民(1963－)，男，河南封丘人，教授，博士，E-mail:huyanmin007@163．com。