高粱种子萌发期耐低温材料的筛选与鉴定

［KH－*D］张丽霞，张明政，张灵敏，霍岩，4，王春语，丛玲

(1．辽宁省农业科学院创新中心，辽宁沈阳110161;2．辽宁省庄河市鞍子山乡农业技术服务站，辽宁庄河116414;3．辽宁医学院食品科学与工程学院，辽宁锦州121000;4．内蒙古赤峰市农牧科学研究院高粱研究所，内蒙古赤峰024031)

高粱种子萌发期耐低温材料的筛选与鉴定

［KH－*3D］张丽霞1，张明政2，张灵敏3，霍岩1，4，王春语1，丛玲1

(1．辽宁省农业科学院创新中心，辽宁沈阳110161;2．辽宁省庄河市鞍子山乡农业技术服务站，辽宁庄河116414;3．辽宁医学院食品科学与工程学院，辽宁锦州121000;4．内蒙古赤峰市农牧科学研究院高粱研究所，内蒙古赤峰024031)

筛选、鉴定耐低温高粱材料及挖掘耐低温基因能极大地促进高粱耐低温品种的培育。本研究利用全球收集的631份高粱材料经过8、6、4和2℃逐步低温处理的方法筛选鉴定，同时统计了高粱粒色与耐低温、染菌率的关系。最终筛选到7份耐低温较强的高粱材料，其中1份来自中国的帚用高粱在2℃低温处理14 d后仍有较高的相对萌发率和相对出苗率。高粱种子萌发期，白粒高粱最易染菌，黄粒高粱次之，红粒高粱染菌率最低。耐低温级别高的材料不同粒色都有分布。表明6℃或更低温度对种子的萌发率和出苗率都具有非常大的影响。随着高粱粒色的逐渐加深，染菌率逐渐降低。

高粱;种子萌发;低温胁迫;相对萌发势;相对萌发率;相对出苗率

植物的抗寒性包括冻害(零下低温)和冷害(零上低温)，常规大田作物在整个生育期遭遇零下低温的极端天气很少，但冷害现象却时常发生。关于水稻耐低温品种的筛选鉴定、耐低温相关基因的定位克隆、耐低温分子调控机制研究以及水稻耐低温育种等方面都有较深入研究［1－4］。玉米关于耐低温的研究报道也较多，鉴定筛选出的耐低温种质资源在实践生产和育种中有重要作用［5－6］。

关于高粱低温冷害方面的研究国内外都有相关报道。在20世纪80年代初，我国就相继开展了关于高粱耐低温材料的筛选、鉴定等研究工作［7－12］。Major(1982)等对Pride P130高梁苗期进行短期低温处理，发现低温虽使开花延迟3 d、分蘖增多，但对株高、叶数、籽粒产量、粒数或粒重的影响较小［13］。Knoll等利用Shan Qui Red(耐低温品种)和SRN39 (低温敏感品种)构建的RIL群体挖掘耐低温相关的QTLs［14－15］。Bekele等揭示在低温胁迫下高粱苗期耐低温的遗传复杂性，且挖掘与非生物胁迫相关的QTLs［16］。但是有关高粱低温相关研究不多，筛选鉴定的方法、指标等不完善，高粱耐低温QTLs、基因挖掘的研究报道较少，基本没有在生产实践中应用。目前高粱生产实践中较为突出的问题之一是高粱播种后遭遇低温，影响种子活力导致出苗率低或在土壤中“粉种”、霉烂，给高粱生产带来较大损失［17－19］。为了促进和加快高粱育种工作，深入开展高粱耐低温研究，首先必须筛选鉴定出适用于生产实践的耐低温材料，也为进一步定位、克隆耐低温基因以及揭示高粱耐低温的分子机制奠定基础。

低温条件下，萌发势和萌发率是评价材料耐低温的重要指标之一，本研究利用人工气候箱对从中国以及其他世界各地收集的631份高粱材料进行种子萌发期耐低温材料筛选、鉴定，从中筛选出优良的耐低温材料以供后期研究使用。

1 材料与方法

1．1 试验材料

本试验收集了中国以及全球不同地区(非洲、亚洲、美洲和北美洲等)、不同类型(甜高粱、粒用高粱、草用高粱、帚用高粱和国内农家种)的高粱材料631份，其中包括国际热带半干旱地区作物研究所(ICRISAT)提供的微核心种质243份，中国国家作物种质库中期库提供国内农家种251份，辽宁省农业科学院创新中心国家高粱改良中心提供甜高粱、草用高粱和国内常规品种等136份和通辽市农科院提供选育品种1份。地区的广泛性和品种的多样性更有利于筛选到优良的耐低温材料。

1．2 试验方法

利用国产MGC-350HP-2型人工气候箱(上海一恒科学仪器有限公司)，对收集到的631份高粱材料8℃低温胁迫处理8天后统计种子的相对萌发势，14 d后统计种子的相对萌发率，随后置于25℃人工气候室的培养架上5 d后统计相对出苗率。萌发以种子露白为标准，出苗以2片子叶完全展开为准。

选取籽粒饱满、均匀一致且无病虫害的风干种子100粒，放在垫有毛巾的发芽盒中，加入一定量的无菌水，使毛巾保持湿润的状态。将发芽盒置于人工气候箱进行低温处理。对照材料置于25℃培养架上3 d后统计种子的萌发率，萌发5 d后统计种子的出苗率。

相对萌发势=(处理后8 d种子的实际萌发率/对照种子萌发率)×100%

相对萌发率=(处理后14 d种子的实际萌发率/对照种子萌发率)×100%

相对出苗率=(处理后种子的实际出苗率/对照种子出苗率)×100%

试验重复2～3次，求平均值进行统计。

统计标准如表1，耐低温级别达到一级的材料继续进行6、4和2℃的低温筛选，14 d后统计相对萌发率，随后统计相对出苗率。

表1 相对萌发势、相对萌发率和相对出苗率统计标准Table 1The statistical standards of relative seed germination vigor，relative germination rates and relative seedling-emergence rates

2 结果与分析

2．1 低温处理对种子相对萌发势、相对萌发率和相对出苗率的影响

低温条件下，种子的萌发势和萌发率是评价品种耐低温的重要指标之一［20］。前人研究结果表明，高粱萌发的最低土温为8～10℃，最适温度为20～30℃，出苗的最低温度为10～12℃，超过20℃出苗率显著增高［9，13，21］。因此，选择8℃处理8 d后统计相对萌发势、14 d后统计相对萌发率、25℃生长5 d后统计相对出苗率，统计标准如表1所示，作为高粱种子萌发阶段耐低温材料的筛选条件。供试的631份材料中相对萌发势达到一级、二级、三级、四级、五级和六级的样品数分别为21、39、48、51、61和411份，占总样品比例分别为3．3%、6．2%、7．6 %、8．1%、9．7%和65．1%。相对萌发率达到一级、二级、三级、四级、五级和六级的样品数分别为91、120、102、88、78和152份，占总样品比例分别为14．42%、19．02%、16．16%、13．95%、12．36%和24．09%。相对出苗率达到一级、二级、三级、四级、五级和六级的样品数分别为308、157、72、45、34和15份，占总样品比例分别为48．81%、24．88%、11．41 %、7．13%、5．39%和2．38%(图1)。25℃培养条件下，3 d后种子萌发率达到最大值。由此可见，8℃低温处理不同程度上影响了种子的萌发势、萌发率和出苗率。利用DPS(Data Processing System)数据处理系统分析了8℃低温胁迫处理后相对萌发势和相对萌发率的相关性，结果表明，相关系数r为0．66、P值为0．0001(相关系数临界值a=0．05时，r= 0．09;a=0．01时，r=0．12)达到极显著正相关，即相对萌发势高的材料最终的相对萌发率也高。一般情况下，大部分材料符合此规律，但也存在8℃低温胁迫处理8 d后相对萌发势较低而处理14 d后相对萌发率却很高的材料。比如相对萌发势达到六级的411份材料中最终相对萌发率达到一级的材料共有18份，占相对萌发率达到一级材料的19．8%。8℃低温处理14 d后置于25℃环境中统计相对出苗率，如图1所示，相对出苗率达到55%以上的材料537份，占样品总数的85．1%。由此可见，8℃低温处理对种子出苗率影响较小。

高粱种子在萌发过程中，8℃低温处理主要是延迟了种子的萌发速度和抑制了部分种子的萌发。低温处理条件下，不同高粱品种间的萌发势和萌发率存在明显差异。一般情况下，萌发速度快且萌发势高的品种，萌发率也高;萌发速度慢且萌发势低的品种，萌发率相应也低。虽有个别材料不符合这个规律，但低温处理下种子的萌发势和萌发率可以作为鉴定耐低温品种的指标之一。

高粱最适萌发温度为20～30℃，温度越高，萌发越快，材料间差异不明显，温度越低，萌发越慢，有的材料萌发率特别低甚至不能萌发，品种间差异显著。萌发阶段，如果想从大量材料中筛选鉴定耐低温级别较高的材料，适当降低胁迫温度或者延长低温胁迫时间。因此，把耐低温级别达到一级的材料继续进行更低温度的胁迫处理，统计相对萌发率和相对出苗率。

首先，将8℃低温处理条件下相对萌发率达到一级的91份材料置于6℃低温处理14 d后统计相对萌发率，随后置于25℃条件下生长5 d统计相对出苗率。如图2所示，91份材料中相对萌发率达到一级、二级、三级、四级、五级和六级的样品数分别为32、13、12、7、5和22份，占试验样品比例分别为35．16%、14．29%、13．19%、7．69%、5．49%和24．18 %。相对出苗率达到一级、二级、三级、四级和五级的样品数分别为17、43、17、8和6份，占试验样品比例分别为18．68%、47．25%、18．68%、8．79%和6．59%。8℃低温处理14 d后，相对出苗率达到一级和二级的样品数分别为308和157份，占总材料的73．69%(图1)。相对萌发率达到一级的91份材料6℃低温处理14 d后，相对出苗率达到一级和二级的样品数分别为17和43份，占总材料的65．93%(图2)。6和8℃低温处理虽然不同程度上影响最终出苗率，但两者的变化趋势相同，相对出苗率达到二级以上的样品数达到60%以上。8℃低温处理对出苗率影响较小，相对出苗率达到一级的材料为308份，占总材料的48．81%。6℃处理较耐低温的91份材料，相对出苗率达到一级的材料为17份，占总材料的18．68%，与8℃相比相对出苗率明显降低。其次，将6℃低温处理相对萌发率达到一级的32份材料置于4℃处理14 d后统计相对萌发率和出苗率，只有7份材料萌发，其他材料均未萌发，其中2份材料相对萌发率达到60%以上且相对出苗率也达到80%以上(表2)。最后，将筛选到的7份材料置于2℃低温处理14d后，只有1份来自中国的帚用高粱具有较高的相对萌发率(32．09 %)和相对出苗率(78．04%)，其余材料未萌发或萌发率特别低。

图1 供试高粱材料相对萌发势、相对萌发率和相对出苗率Fig．1The relative seed germination vigor，relative germination rates and relative seedling-emergence rates of tested sorghum materials

图2 91份高粱材料相对萌发率和相对出苗率Fig．2The relative germination rate and relative seedling-emergence rates of tested sorghum materials

表2 供试材料的相对萌发率和相对出苗率Table 2The relative germination rate and relative seedling-emergence rate of tested sorghum materials

2．2 粒色与耐低温的关系

本研究所用的631份材料中，粒色为白色、黄色和红色的材料分别为153、61和417份，占总材料的24．25%、9．67%和66．09%。相对萌发率达到一级的材料共有91份，其中白粒47份、黄粒7份和红粒37份，分别占相对萌发率达到一级材料的51．65 %、7．69%和40．66%(表3)。

张桂香等对238份高粱材料进行了高粱芽期耐冷性鉴定与评价，从中筛选出芽期耐冷种质15份，其中白粒5份、黄粒2份、红粒7份及褐色粒1份，表明高粱材料的耐冷性与粒色有某种关系，耐低温级别高的材料粒色大都表现为较深的颜色［12］。本研究中8℃低温处理后相对萌发率达到一级的白粒材料47份，占白粒材料的30．72%;黄粒7份，占黄粒材料的11．48%;红粒37份，占红粒材料的8．87 %(表3)。红粒材料最多，但筛选到的较耐低温材料比例却最低，和前人的研究结果正好相反。因此，关于高粱粒色与耐低温的关系还有待进一步地分析研究。

表3 高粱粒色Table 3The sorghum grain color

表4 粒色与染菌情况Table 4The sorghum grain color and infection rates

2．3粒色与染菌的关系

如表4所示，粒色为白色的材料153份，其中8℃低温处理14后没有染菌的材料16份，染菌的材料137份，分别占白粒材料的10．46%和89．54%。黄粒材料61份，黄粒没有染菌29份，黄粒染菌32份，分别占黄粒材料的47．54%和52．46%。红粒材料417份，其中没有染菌373份，染菌44份，分别占红粒材料的89．45%和10．55%。由此可见，白粒材料最易染菌，红粒材料染菌率较少，随着粒色颜色的加深，染菌率逐渐降低。

高粱种子在低温高湿的环境下容易产生烂种的危险，染菌率高及染菌严重将增加烂种的机会。春季播种时，如果处在低温高湿的环境如有可能尽量选择粒色较深的材料，尽量减少烂种的机会，保证出苗率。

3 讨论与结论

由于播种地点和播种时间的差异，在早春播种时，高粱常常受到低温胁迫因而影响种子萌发、出苗以及后期的植株生长，最终影响产量［22］。低温损伤已经严重影响高粱生产，高粱冷害问题也越来越受到人们的重视。因此，筛选耐低温种质资源、挖掘耐低温基因、应用到今后的品种选育中显得尤为重要。

关于低温对高粱生产的影响以及耐低温材料的筛选已有相关报道。潘铁夫等对吉林省全省(以长春为代表)、蛟河(温度较低)和怀德(温度较高)等地区1950－1975年连续统计了26年低温对高梁产量的影响以及低温对高梁生长发育的影响等，统计数据显示抽穗灌浆期低温对高粱的产量影响最为显著，且低温对高梁生长发育的各个时期都有明显的延迟作用［23］。陈香兰等利用国内外1398份高粱开展了种子萌发期和幼苗期的耐低温筛选鉴定，其中利用471份高粱材料进行种子萌发期的耐低温筛选，筛选条件是4℃低温处理7 d后置于25～30℃培养箱中培养3～5 d统计萌发率，萌发率达到85 %以上的材料有217份，占试验材料的46%［7］，也就是说近一半的材料萌发率都很高，筛选条件不够苛刻，难以筛选出极端耐低温的材料，无法应用到生产实践。

田间进行高粱低温筛选误差较大，每年同期气温变化较大，难以保证试验的重复性。纪秀媛早在1978－1980年间对朝阳地区晋杂一号高粱采取分期播种方法找出了低温灾害发生的时间、指标、特点、类型及防御措施，但由于试验品种单一，不利于其他地区选择耐低温品种［24］。马世均等对国内外不同生态类型的115份高粱材料进行低温处理筛选耐低温品种，检测低温条件下不同品种的种子吸水量与种子萌发率的关系以及干胚膜脂肪酸组分差异与品种耐低温的关系［10］。张桂香等对来自中国、美国和印度等国505份高粱品种进行了种子萌发期、芽期和苗期室内耐低温筛选，根据实验数据确定种子萌发阶段，1～2℃处理5～8 d后12～15℃统计最终的出苗率，认为此方法能更好地反映出不同品种出苗率的差异性以达到优胜劣汰的目的［12］，但是采用的505份材料中到底有多少份材料出苗率表现一级抗性等具体数据未见报道。

631 份供试高粱材料经过8℃低温胁迫处理，相对萌发势、相对萌发率和相对出苗率达到一级的材料分别为21、91和308份，占总材料的3．33%、14．42%和48．81%(图1)。8℃低温处理明显抑制了种子的萌发势和萌发率，但对最终的出苗率影响较小。相对萌发率达到一级的91份材料经过6℃低温处理后，相对萌发率和相对出苗率达到一级的材料分别为32和17份(图2)。随后将32份材料进行4℃低温处理，只有7份材料萌发，其中2份材料相对萌发率达到60%以上，5份材料相对出苗率超过70%以上。筛选到的7份耐低温较强的材料经过2℃低温处理后，其中1份来自中国的帚用高粱仍有较高的相对萌发率和相对出苗率(表2)。6℃或更低温度对种子的萌发率和出苗率都具有非常大的影响。

高粱种子萌发期，白粒高粱最易染菌，黄粒高粱次之，红粒高粱不易染菌。随着高粱粒色的逐渐加深，染菌率逐渐降低。

致谢:对本研究材料的提供方辽宁省农业科学院创新中心国家高粱改良中心、国际热带半干旱地区作物研究所、中国国家作物种质库中期库和通辽市农科院表示感谢。材料收集过程中得到了国家高粱产业体系首席专家邹剑秋老师的大力支持，在此提出特别感谢。

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(责任编辑 李洁)

Screening and Identification of Low-temperature Resistant Materials at Seed Germination Stage

ZhANG Li-xia1，ZhANG Ming-zheng2，ZhANG Ling-min3，HUO Yan1，4，WANG Chun-yu1，CONG Ling1
(1．Innovation Center，Liaoning Academy of Agricultural Sciences，Liaoning Shenyang 110161，China;2．Anzishan Agricultural Technology Service Station of Liaoning，Liaoning Zhuanghe 116414，China;3．College of Food Science and Engineering，Liaoning Medical University，Liaoning Jinzhou 121000，China;4．Sorghum Research Institute，Chifeng Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences，Inner Mongolia Chifeng 024031，China)

Screening and identification the low-temperature resistant materials and genes can greatly promote the cultivation of the low-temperature resistant varieties of sorghum．631 sorghum materials，from the whole world，were treated by the method of 8，6，4 and 2℃stepwise selection．Meanwhile，we discussed the relationship between sorghum grain color and low-temperature resistant property and the infection rate．7 higher low-temperature resistant materials were obtained，and 1 broom sorghum from China had the higher relative germination rate and relative seedling-emergence rate after 2℃low-temperature treatment for 14 d．Compared with yellow sorghum and red sorghum，white sorghum is easiest to infect bacteria at the seed germination stage．Red sorghum is most difficult to infect bacteria．More low-temperature resistant materials have different grain color．6℃or lower temperature treatment will have very significant effect on the germination rate and seedling-emergence rate．With the deepening of sorghum grain color，the infection rate is gradually reduced．

Sorghum bicolor;Seed germination;Low-temperature stress;Relative germination vigor;Relative germination rate;Relative seedling-emergence rate

S514

A

1001－4829(2017)1－0020－06

10．16213/j．cnki．scjas．2017．1．005

2016－02－23

国家现代农业产业技术体系项目“高粱重要抗性资源鉴定筛选与种质创新(CARS-06-01-06)”;辽宁省科技攻关项目“主要作物生物育种技术研究(2011208001)”;国家自然科学基金“高粱茎秆蜡层缺失突变体sb1基因克隆及功能研究(31500203)”。

张丽霞(1981－)，女，内蒙古乌拉特前旗人，博士研究生，助理研究员，研究方向:高粱、玉米抗逆基因挖掘及功能鉴定，E-mial:zhanglx993@sohu．com。