白菜型冬油菜和春油菜及杂交F1代质外体抗冻蛋白的SDS-PAGE电泳分析

［KH－3D］方园，刘林波，孙万仓，刘自刚，杨刚，袁金海，马骊，侯献飞，王凯音，郭仁迪，陈奇，王治江，刘海卿，钱武，赵艳宁，米超

(甘肃省油菜工程技术研究中心，甘肃省干旱生境作物重点实验室/甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室/甘肃省干旱生境作物学重点实验室，甘肃农业大学农学院，甘肃兰州730070)

白菜型冬油菜和春油菜及杂交F1代质外体抗冻蛋白的SDS-PAGE电泳分析

［KH－*3D］方园，刘林波，孙万仓*，刘自刚，杨刚，袁金海，马骊，侯献飞，王凯音，郭仁迪，陈奇，王治江，刘海卿，钱武，赵艳宁，米超

(甘肃省油菜工程技术研究中心，甘肃省干旱生境作物重点实验室/甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室/甘肃省干旱生境作物学重点实验室，甘肃农业大学农学院，甘肃兰州730070)

为探讨质外体抗冻蛋白能否作为冬油菜抗寒评价的一项新指标，本研究利用SDS-PAGE凝胶电泳对白菜型冬油菜‘陇油7号’和‘陇油9号’与优质春油菜Parkland及其杂交F1代质外体抗冻蛋白进行了检测。结果表明，低温胁迫前所有单株质外体抗冻蛋白电泳图谱颜色浅，其含量较低。低温胁迫后，各单株质外体抗冻蛋白电泳图谱颜色加深，含量增加，且单株间差异较大。冬性亲本和能够越冬单株质外体抗冻蛋白电泳图谱颜色深，而春性亲本与不能越冬单株的颜色浅。由此说明，质外体抗冻蛋白作为抗寒评价的新指标是可行的，试验中筛选出的一些抗寒性状优良的单株，可为冬油菜抗寒品种的选育和改良提供一定的基础材料和理论依据。

白菜型油菜;杂交一代;抗寒性;质外体;抗冻蛋白;SDS-PAGE电泳

白菜型油菜(Brassica rapa L．)作为油菜三大类型之一，在我国油菜生产和发展中占据着重要地位。其中，白菜型冬油菜与春油菜是我国西北地区主要的油料作物。近年来白菜型强抗寒冬油菜品种的选育和应用，基本解决了北方油菜安全越冬的问题，促进了北方旱寒区冬油菜的发展，产生了巨大的生态效益和经济效益［1］。但目前生产上应用的冬油菜品种品质都不太理想，芥酸和硫苷含量偏高，迄今，国内外尚未见白菜型冬油菜双低品种的报道。杂交育种是创造作物新品种最传统也是最行之有效的方法之一。因此，通过杂交将白菜型春油菜的优良品质引入白菜型冬油菜不乏是解决白菜型冬油菜品质问题的有效途径。但利用SDS-PAGE法研究白菜型冬、春油菜杂交对其杂交后代质外体抗冻蛋白的表达量差异的影响也未见报道。有学者研究表明植物抗寒性高低与质外体抗冻蛋白的表达量有关［2－3］，所以研究白菜型冬、春油菜杂交后代的非质体抗冻蛋白有助于了解其抗寒性变化，对选育品质优良的白菜型冬油菜具有现实意义。

近年来人们对冬油菜抗寒性的不断深入研究，已在植物学特性［4－5］、生理生化［6–8］、抗寒基因［9－10］等方面取得了重大突破。冬油菜抗冻蛋白(AFPs)的发现，推进了冬油菜抗寒性研究新进展。1964年抗冻蛋白(AFPs)在黄粉甲幼虫中第一次被发现后［11］，经过半个世纪的研究，今天人们已经在鱼类［12－13］、昆虫［14－16］、植物［17］、细菌和真菌［18］等多种生物中均发现抗冻蛋白(AFPs)的存在。迄今为止，鱼类、昆虫的AFPs研究已经非常深入和系统，而植物中AFPs的发现比较晚［17，19］。1992年，Griffith等［17］第一次从经低温锻炼的能够忍受细胞外结冰的冬黑麦(Secale cereale)叶片质外体中得到并部分纯化了AFPs，开启了植物抗冻蛋白的研究先河。之后人们在沙冬青(Ammopiptanthus monglicus)［20］、高山植物唐古特红景天［21］、胡萝卜(Daucus carota)［22］、珠芽蓼(Polygonumviviparum)［23］和冬小麦［24，26］等许多植物中发现了AFPs，然而一直无冬油菜方面的研究报道。直到2012年，甘肃农业大学油菜遗传育种实验室［25］从白菜型冬油菜陇油6号的叶片及根部提取了质外体蛋白，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳发现在33～45 K之间有一条特异性条带，经质谱分析鉴定，该条带为β-1-3-葡聚糖酶，这种酶在冬黑麦中已被证明为抗冻蛋白(AFPs)［15］，具有冰晶修饰活性。

本研究以白菜型冬油菜与春油菜的杂交F1代及亲本为试验材料，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，比较试验材料各单株质外体中抗冻蛋白β-1-3-葡聚糖酶的差异，并结合各单株的越冬情况来探讨抗冻蛋白作为冬油菜抗寒评价的一项新指标的可行性及杂交后代的抗寒性，以期为冬油菜抗寒育种提供基础材料和理论依据。

1 材料与方法

1．1 试验材料

本试验所用材料为白菜型冬油菜‘陇油7号’、‘陇油9号’和春油菜Parkland以及冬春杂交F1代，均由甘肃农业大学农学院油菜课题组提供，详见表1。试验材料于2014年8月25日播种于兰州沙井驿试验点，常规管理。

表1 试验材料Table 1Tested materials

该试验设计低温胁迫前(2014年10月1日，10～23℃)和低温胁迫后(2014年11月18日，－3～10℃)2个处理，单株提取质外体蛋白，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，比较降温前后材料间抗冻蛋白的差异。第2年返青后统计各单株越冬情况。

1．2 试验方法

1．2．1 油菜质外体蛋白的提取①质外体蛋白提取。a去除油菜叶片枯黄和干死部分，流水冲流10 min，用ddH2O冲洗2遍，每单株取5 g;b滤纸吸干表面水分后，切成1 cm长条，用提取缓冲液浸洗2～3遍;c然后将切成条的叶片放入塑料杯中，加入80～100 mL上述缓冲液，抽真空，一般7～10 min;d倒掉缓冲液，用吸水纸吸去叶片表面溶液后放入30 mL注射器，将注射器放入50 mL离心管，6140 r/ min，4℃，15 min离心，收集离心管底部液体，即为非质体提取物。②非质体提取物提纯。a把提取物加入5倍体积的冷丙酮，在－20℃沉淀20 h后，10 000 r/min，4℃，30 min离心，弃去丙酮，沉淀在－20℃挥发丙酮，获得冻干蛋白样品;b用巯基乙醇溶解上面冻干蛋白样品，充分溶解，在10 000 r/min，4℃，15 min离心，取上清液，在－20℃保存备用。

1．2．2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE参考郭尧君等［26］的方法，采用4%浓缩胶和15%的分离胶。上样量为每孔10～15 μg蛋白，电泳时，浓缩胶电压为80 V，待溴酚兰指示剂进入分离胶后电压调至150 V，开启冷凝系统，电泳约3 h后指示剂接近前沿，结束电泳取下玻璃板上的凝胶，用ddH20冲洗掉凝胶上的电极缓冲液后，考马斯亮蓝R-250染色1．5 h，脱色过夜。

1．2．3 越冬统计与抗寒性冬前单株挂牌标记，第2年返青后一一统计各单株的越冬情况，安全越冬记为是(Y)，不能越冬记为否(N)，以越冬情况评价抗寒性的优劣。安全越冬的材料记为抗寒性优良，反之，为抗寒性差的材料。

2 结果与分析

2．1 越冬统计

越冬率是植物抗寒性强弱的直观体现。翌年返青后对试验中两个杂交组合材料的越冬情况进行统计，结果列于表2。其中Parkland为白菜型春油菜，于2014年8月25日大田播种后，9月28日现蕾，其在越冬前已经抽薹开花，在进入冬季后被冻死，因此表中无统计数据;而陇油7号和陇油9号抗寒性表现优异，在兰州沙井驿越冬率分别为87．46%和80．00%。F1代中部分单株未能越冬，抗寒性发生分离，这可能与白菜型油菜自交不亲和导致亲本自身杂合有关。从统计结果来看，陇油7号与Parkland杂交F1代越冬率为70．59%，高于陇油9号与Parkland杂交F1的61．11%，这与冬性亲本的抗寒性表现一致。

表2 亲本及杂交F1代越冬统计Table 2Overwintering statistics of parents and their hybrids their first-filial generations

2．2 陇油7和Parkland及其杂交F1代抗冻蛋白检测

从图1看出，各单株质外体蛋白条带很弱，说明质外体中蛋白含量低，有人研究表明该抗冻蛋白是一种低温胁迫诱导蛋白，降温前由于不受低温胁迫反应，质外体蛋白表达量很少。降温后，从图2看出所有材料的蛋白条带颜色加深，并且所有单株都存在β-1-3-葡聚糖酶条带，但材料间其含量差异较大。其中春性亲本Parkland和F1代有些单株的蛋白条带较陇油7号和其他单株弱，说明低温胁迫后在春性亲本Parkland和F1代某些单株质外体中分泌合成的蛋白量较少，从表2看出未能越冬。另外，在26～33 k之间出现了一条特异条带，通过查阅文献，认为冬油菜体内不止含有β-1-3-葡聚糖酶一种抗冻蛋白，应该还含有其它一种或多种新的抗冻蛋白，目前还没鉴定出来。

图1 低温胁迫前陇油7号和Parkland及其杂交后代质外体蛋白电泳图谱Fig．1SDS-PAGE electrophoretogram of the protein in the apoplast of Longyou7，Parkland and their first-filial generation before low temperature stress

图2 低温胁迫后陇油7号和Parkland及其杂交后代质外体蛋白电泳图谱Fig．2SDS-PAGE electrophoretogram of the protein in the apoplast of Longyou9，Parkland and their first-filial generation after low temperature stress

2．3 陇油9号和Parkland及其杂交F1代抗冻蛋白检测

在降温前和降温后对陇油9号和Parkland及杂交后代的质外体蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，整个变化趋势与陇油7号和Parkland杂交组合一致。从图3看出，各单株质外体蛋白条带很弱。在降温前，该蛋白没有被大量表达，但还是少量存在着。降温后，所有材料质外体蛋白条带颜色加深(图4)，材料间差异较大。Parkland与F1代的第3、5、8、9、12和15等单株蛋白条带较其他材料颜色浅，质外体分泌蛋白较少，未能越冬。另外，通过电泳发现质外体中存在多种与低温诱导相关的蛋白质。

3 讨论与结论

在北印第安那州的一项研究表明抗冻蛋白是一类低温诱导蛋白质［27］，当抗寒植物受到冻害或低温胁迫时，为适应生态环境，植物会发生一系列生理变化来适应低温胁迫，其体内会合成分泌多种蛋白质-低温诱导蛋白。AFPs是低温诱导蛋白中的一类，具有冰晶形态效应、热滞效应(Thermal Hysteresis，TH)、重结晶抑制效应(Recrystallization Inhibition)［28－29］。AFPs的3个特性表明，在低温下它与冰晶的形成直接相关，因此对植物的保护具有直接性;而其它低温诱导蛋白间接调节酶或通过信号传导等一系列温度适应与AFPs共同来调节植物的抗寒性［30－31］。

本研究中，低温胁迫前所有材料质外体抗冻蛋白含量很少，低温胁迫后，其含量迅速增加。另外，在质外体蛋白电泳条带中出现了许多特异性条带，它们应是尚未被鉴定的其他低温诱导蛋白，是否为抗冻蛋白还需要进一步的研究。从各单株的越冬情况来看，能够越冬单株在低温胁迫后质外体蛋白含量较不能越冬单株含量高，蛋白电泳图中条带颜色深。可见该抗冻蛋白在抵御外界低温胁迫中起到重要作用，可作为抗寒评价的一项指标。

图3 低温胁迫前陇油9号和Parkland及其杂交后代质外体蛋白电泳图谱Fig．3SDS-PAGE electrophoretogram of the protein in the apoplast of Longyou9，Parkland and their first-filial generation before low temperature stress

图4 低温胁迫后陇油9号和Parkland及其杂交后代质外体蛋白电泳图谱Fig．4SDS-PAGE electrophoretogram of the protein in the apoplast of Longyou9，Parkland and their first-filial generation after low temperature stress

冬油菜的抗寒性是一个非常复杂的生理过程，研究其抗寒性应该将植物学学特征、生理生化、抗冻蛋白和抗寒基因结合起来，制定出一套完整的抗寒指标才能对其抗寒性进行全面的评价和鉴定。通过本研究，根据各试验材料抗冻蛋白条带的差异并结合返青后它们的越冬情况，可以筛选出一些具有优良性状的单株，为白菜型冬油菜抗寒育种提供基础材料和理论依据。

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(责任编辑 陈虹)

SDS-PAGE Electrophoresis Analysis on Apoplast Antifreeze Protein in Winter and Spring Turnip Rape(Brassica rape L．) and Their First-filial Generation

FANG Yuan，LIU Lin-bo，SUN Wan-cang*，LIU Zi-gang，YANG Gang，YUAN Jin-hai，MA Li，HOU Xian-fei，WANG Kai-yin，GUO Ren-di，CHEN Qi，WANG Zhi-jiang，LIU Hai-qing，QIAN Wu，ZHAO Yan-ning，MI Chao
(Campestrisseed Engineering Research Center of Gansu Province，Gansu Provincial Key Laboratory of Arid Land Crop Sciences，Improvement and Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement，Gansu Agricultural University，Gansu Lanzhou 730070，China)

In order to explore a new evaluation of cold resistance and the basis for equality improvement and cold resistance breeding in winter turnip rape(Brassica rapa L．)in the north of China，the apoplast antifreeze proteins in winter turnip rape Longyou7，Longyou9，spring turnip rape Parkland and their first-filial generation were detected by SDS-PAGE．The result showed that the SDS-PAGE electrophoretogram of the apoplastic antifreeze protein in individual plant were lighter before low temperature stress，and its content decrease;And darker after low temperature stress，and its content increased．The SDS-PAGE electrophoretogram of the apoplastic antifreeze protein in winter parents and the individuals which could survive in winter was darker than that of the spring parent and the individuals which could not survive in winter based on the individual overwintering．It was feasible to evaluate cold resistance by apoplast antifreeze protein as new index，and some excellent cold resistance plants were selected，which could provide the basis for equality improvement and cold resistance breeding in winter turnip rape．

Turnip rape(Brassica rapa L．);First-filial generation;Cold resistance;Apoplast;Antifreeze protein; SDS-PAGE electrophoresis

S634．3

A

1001－4829(2017)1－0034－06

10．16213/j．cnki．scjas．2017．1．007

2016－01－16

国家自然科学基金项目(31460356，31560397，31660 404);农业部产业技术体系项目(CARS-13);国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2015CB150206);国家农业科技成果转化项目(2014G10000317);“油菜杂种优势利用技术与强优势杂交种创制”项目(2016YFD0101300)

方园(1989－)，女，甘肃景泰人，硕士研究生，研究方向作物遗传育种，E-mail:1032400251@qq．com;*为通讯作者:孙万仓(1957－)，男，甘肃会宁人，教授，博士，主要从事油菜育种及十字花科种质资源研究，E-mail:18293121851@163．com。