［反］-β-法尼烯(EβF)合成酶基因在玉米中的转化与筛选

［KH－*3D］邢小龙，常纪苹，付忠军，胡德升，胡彦民*

(1．河南农业大学农学院/河南粮食作物协同创新中心，河南郑州450002;2．重庆市农业科学院，重庆401329)

［反］-β-法尼烯(EβF)合成酶基因在玉米中的转化与筛选

［KH－*3D］邢小龙1，常纪苹1，付忠军2，胡德升1，胡彦民1*

(1．河南农业大学农学院/河南粮食作物协同创新中心，河南郑州450002;2．重庆市农业科学院，重庆401329)

为获得转基因抗虫玉米，将［反］-β-法尼烯(EβF)合成酶基因导入玉米，并进行鉴定和筛选。在［反］-β-法尼烯(EβF)合成酶基因的两端分别添加Nco I和Bam H I酶切位点，并进行人工合成。将EβF合成酶基因与植物表达载体pFGC5941连接，经双酶切和测序鉴定。结果表明:重组表达载体pFGC5941-EβF构建成功;载体pFGC5941-EβF转化农杆菌EHA105后用玉米芽尖侵染法将EβF合成酶基因导入玉米自交系郑58中，对转化植株进行除草剂抗性筛选以及EβF合成酶基因和bar基因的PCR鉴定后，共得到18株转基因阳性植株。

［反］-β-法尼烯(EβF)合成酶基因;玉米;表达载体构建;转基因植株

［反］-β-法尼烯(EβF)合成酶基因是植物体内催化法尼基焦磷酸(FPP)合成EβF的关键酶基因。EβF作为大多数蚜虫报警信息素的主要甚至唯一成分，是一种重要的倍半萜烯类化合物［1－3］，当蚜虫受到天攻击时，其体内会产生EβF，以使其他蚜虫逃离，从而停止对作物的危害。EβF对蚜虫有强烈的驱避作用，并能吸引蚜虫天敌，从而有较好的抗蚜效果。Beale等［4］将欧洲薄荷EβF合成酶基因转入拟南芥，转基因植株对蚜虫产生警戒反应并吸引蚜虫寄生性天敌蚜茧蜂。Foster等［5］研究发现，产生抗药性的蚜虫对EβF反应变得迟钝，故利用EβF充分吸引蚜虫天敌可有效控制抗药性蚜虫。

目前该基因已先后从欧洲薄荷，香橙，花旗松，黄花蒿中得到分离和鉴定［6－9］。近年来研究人员又将EβF合成酶基因成功导入拟南芥，烟草，水稻［10－12］等作物中，培育了多种转基因抗虫植株。笔者借鉴前人经验，以EβF合成酶基因构建重组表达载体pFGC5941-EβF并转入玉米自交系郑58，得到转化植株，然后进行鉴定和筛选，为获得抗虫玉米材料奠定基础。

1 材料与方法

1．1 供试材料

受体材料:郑58，玉米优良自交系;菌株:大肠杆菌DH5α，根癌农杆菌EHA105，由本实验室保存;［反］-β-法尼烯(EβF)合成酶基因由苏州金唯智生物科技有限公司合成;基因测序由北京奥科鼎盛生物科技有限公司完成。

1．2 植物表达载体的构建

在［反］-β-法尼烯(EβF)合成酶基因(1653 bp)两端分别引入Nco I和Bam H I酶切位点，委托苏州金唯智生物科技有限公司合成，得到两端带酶切位点的目的基因，并用Nco I和Bam H I对其进行双酶切。将植物表达载体pFGC5941用Nco I和Bam H I双酶切后回收载体骨架，表达载体骨架与目的基因按摩尔数之比1∶5的比例混合，然后加入2 μl 10×T4DNA Ligase buffer和1μl T4DNA连接酶，补足灭菌水至终反应体积20 μl，22℃连接30 min。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞、双酶切和测序鉴定，以确定成功构建重组表达载体pFGC5941-EβF。

1．3 转基因植株的转化

培养大肠杆菌阳性克隆子，提取阳性大肠杆菌的质粒DNA，并用液氮冻融法转化农杆菌，然后对其进行菌落PCR鉴定，培养阳性农杆菌，通过农杆菌侵染法转化郑58种子。

1．4 转基因植株的PCR检测

取转化后的玉米植株叶片，采用CTAB法提取玉米基因组DNA。根据［反］-β-法尼烯(EβF)合成酶基因序列设计PCR引物。EβF合成酶基因的上下游引物为EβF-F1，ccatggctacaaacggcgtc;EβF-R1，ggatcctcaaaagactatggcatcaacaaag扩增产物片段大小为1661 bp。PCR反应体系为25 μl 2×PCR buffer，1 μl dNTPs，0．2 μl DNA模板，上下游引物各2 μl，1 μl DNA Polymerase，加灭菌水至50 μl，PCR扩增程序为95℃预变性3 min，95℃变性15 s，58℃退火15 s，72℃延伸90 s，进行35个循环最后72℃彻底延伸5 min。扩增产物用1．2%琼脂糖凝胶电泳检测。

1．5 转基因植株的除草剂抗性检测

将PCR检测阳性的幼苗移栽至大田，自交授粉收获种子。将收获的玉米种子播种在营养钵内，放置人工气候室内培养，待转基因幼苗长至3叶期时，喷洒0．2%的PPT溶液进行除草剂筛选，每天1次，连续喷洒2，5 d后观察结果。

2 结果与分析

2．1 重组表达载体pFGC5941-EβF的构建

用Nco I和Bam H I对质粒pFGC5941进行双酶切，切去的片段大小为1388 bp，琼脂糖凝胶电泳检测，产生2条带，大小与预期一致。切胶回收长度为10 017 bp的载体骨架。将目的基因与切胶回收得到的载体骨架用T4连接酶进行连接(图1)。

2．2 重组表达载体鉴定

2．2．1 双酶切鉴定重组表达载体pFGC5941-EβF经双酶切后产生10 017 bp的大片段和1661 bp的目的小片段。

双酶切鉴定结果表明，目的基因EβF合成酶基因已成功连接到pFGC5941载体上，构建的表达载体pFGC5941-EβF正确(图2)。

2．2．2 测序鉴定重组表达载体构建后，转化大肠杆菌，提取质粒，再对目的基因进行测序，经与目的基因进行比对，序列完全一致，测序结果见图3。

2．3 转基因植株获得

经农杆菌介导的玉米芽尖遗传转化、转化后植株的PCR检测，共得到22株拟转基因植株(图4)。

2．4 转化植株除草剂抗性分析

图1 Nco I和BamH I双酶切电泳图Fig．1Electrophoretogram of products digested by double enzymes

图2 重组表达载体pFGC5941-EβF的双酶切鉴定Fig．2Identification of the recombinant expression vector pFGC5941-EβF by double enzyme digestion

22株拟转基因植株自交授粉结实后，对其后代分别进行除草剂抗性筛选，幼苗长至3叶期时，喷洒0．2%的PPT溶液，每天1次，连续喷洒2 d，5 d后观察结果。结果显示，22株转化玉米植株中18株表现出除草剂抗性，可初步确定这18株为转基因阳性植株(图5)。

图3 EβF合成酶基因的测序Fig．3Sequence of EβF synthase gene

图4 EβF合成酶基因PCR检测Fig．4EβF synthase gene PCR detection of putative transformant

图5 T1代植株除草剂筛选Fig．5T1 plantlets herbicide-resistant test

2．5 转基因阳性植株PCR检测

根据Bar基因序列设计PCR引物，上游引物为Bar-F1;gcaccatcgtcaaccactacat下游引物为Bar-R1，tgtgcctccagggacttca扩增产物片段大小为286 bp。琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，阳性对照及除草剂抗性植株均能扩增出目的基因片段，而阴性对照不能扩增出目的条带。Bar引物扩增片段与预期大小286 bp相符。PCR检测进一步确定了除草剂抗性的18株植株为转基因阳性植株，表明抗虫基因EβF合成酶基因已整合到玉米基因组中(图6)。

图6 Bar基因PCR检测Fig．6Bar gene PCR detection of putative transformant

3 结论与讨论

本研究将［反］-β-法尼烯(EβF)合成酶基因与植物表达载体pFGC5941连接，成功构建pFGC5941-EβF重组表达载体，采用液氮冻融法转化农杆菌EHA105，然后用农杆菌侵染玉米芽尖将EβF合成酶基因转入玉米自交系郑58，并对转化植株进行PCR检测和除草剂抗性筛选，共获得18株转基因阳性植株。

英国洛桑研究所2005年从欧洲薄荷中克隆到［反］-β-法尼烯(EβF)合成酶基因，该基因有1653个核苷酸组成，编码550个氨基酸［6］。由于［反］-β-法尼烯(EβF)合成酶基因对蚜虫有明显的驱避作用［4，10，13］，该基因越来越多地被应用到基因工程中。本研究选用的35S启动子是一种强启动子，可提高转基因玉米［反］-β-法尼烯(EβF)的表达水平，提高其抗虫性，被广泛应用于植物基因转化中。为了得到更加纯合的转基因植株，需要对转基因植株的后代进行进一步的分子检测如Southern blotting和Western blotting等，经过连续多代自交筛选，可得到纯合的转基因植株。另外，EβF合成酶基因还可以与Bt基因或其他抗虫基因构建双价或多价抗虫植物表达载体，拓宽抗虫谱，培育出具有高效广谱抗虫性的转基因玉米。

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(责任编辑 陈虹)

Transformation of(E)-β-farnesene Synthase Gene into Maize and Preliminary Screening

XING Xiao-long1，CHANG Ji-ping1，FU Zhong-jun2，HU De-sheng1，HU Yan-min1*
(1．College of Agronomy，Henan Agricultural University/Collaborative Innovation Center of Henan Grain Crops，Henan Zhengzhou 450002，China;2．Chongqing Academy of Agricultural Sciences，Chongqing 401329，China)

To obtain insect-resistant transgenic maize，(E)-β-farnesene synthase gene was transferred into maize，which was identified and screened．The Nco I and Bam H I enzyme cutting sites were separately added at both ends of the(E)-β-farnesene synthase gene．This sequence was artificially synthesized．The desired gene was ligated into vector pFGC5941 by double enzyme digestion and DNA ligase to construct ecombinant expression vector pFGC5941-EβF，which were sequenced and identified by double enzyme digestion．The result showed that the vector pFGC5941-EβF was successfully constructed．Then pFGC5941-EβF was transformed into Agrobacterium tumefaciens EHA105 that infected shoot apical growing point of maize Zheng58．The transgenic maize plants were identified by herbicide-resistant and PCR amplification for bar and EβF synthase genes，and a total of 18 positive transgenic maize plants were obtained．

(E)-β-farnesene synthase gene;Maize;Construction of expression vector;Transgenic plants

S513．038

A

1001－4829(2017)1－0001－04

10．16213/j．cnki．scjas．2017．1．001

2016－01－10

国家自然科学基金项目(31071431)

邢小龙(1989－)，男，河南舞阳人，从事玉米生物技术育种研究，E-mail:xingxiaolong2013@163．com，*为通讯作者:胡彦民，E-mail:huyanmin007@163．com。