H3N2亚型犬流感病毒NP蛋白的表达纯化及多克隆抗体制备

王晓丽，毕振威，王永山，潘群兴，欧阳伟，夏兴霞，诸玉梅

（江苏省农业科学院兽医研究所 农业部兽用生物制品工程技术重点实验室 国家兽用生物制品工程技术研究中心，南京 210014）

·研究论文·

H3N2亚型犬流感病毒NP蛋白的表达纯化及多克隆抗体制备

王晓丽，毕振威，王永山，潘群兴，欧阳伟，夏兴霞，诸玉梅

（江苏省农业科学院兽医研究所 农业部兽用生物制品工程技术重点实验室 国家兽用生物制品工程技术研究中心，南京 210014）

将分离的H3N2亚型犬流感病毒（Canine influenza virus，CIV）A/Canine/Nanjing/11/2012（H3N2）株的核蛋白（NP）基因克隆至原核表达载体pET28a（+）中，构建重组表达质粒pET-NP，然后转化大肠杆菌E.coli Rosetta（DE）感受态细胞，经IPTG诱导后，采用SDS-PAGE和Western blot进行分析。结果显示，大肠杆菌表达的重组NP蛋白的分子量约为61 kDa，与预期相符，并能与犬CIV阳性血清发生特异性反应。将表达的重组NP蛋白进行纯化后，免疫大白兔制备抗NP蛋白多克隆抗体血清，Western blot检测该血清可与CIV的NP蛋白发生特异性反应，间接ELISA检测该多克隆抗体血清的效价达1∶30 000，显示了较高的抗体效价。本研究为CIV快速检测方法的建立和流行病学调查奠定了科学依据。

犬流感病毒；H3N2亚型；核蛋白；原核表达；多克隆抗体

犬流感（canine influenza，CI）是由犬流感病毒（Canine influenza virus，CIV）感染犬引起咳嗽、喷嚏、流涕、发热、呼吸困难等症状的呼吸系统传染病[1]。自2007年韩国发生由禽源H3N2亚型流感病毒引起的犬流感疫情以来，该亚型流感病毒已在犬中广泛传播，被认为是犬流感新的病原体[2,3]。血清学调查显示我国家犬普遍呈现H3N2亚型犬流感病毒抗体阳性[4,5]，在广东省、江苏省、北京市、辽宁省和浙江省等地均分离出多株禽源H3N2亚型的犬流感病毒[6-9]。除了H3N2亚型犬流感病毒外，目前已发现多种亚型A型流感病毒也可以感染犬，包括人流感病毒H3N2亚型、2009年中国流行的H1N1亚型、马流感病毒H8N3亚型、高致病性禽流感病毒H5N1亚型、低致病性禽流感病毒H9N2亚型和H10N8亚型[10]。因此，犬可能在流感病毒的储存、传播和进化中扮演着重要的角色，其公共卫生意义值得高度重视。

A型流感病毒属于正粘病毒科，基因组由8个独立的RNA片段组成，编码聚合酶蛋白（PB2和PB1）、核蛋白（NP）、血凝素蛋白（HA）、神经氨酸酶蛋白（NA）、基质蛋白（M1和M2）和非结构蛋白（NS1和NS2）[11]。其中，NP蛋白由A型流感病毒基因片段5编码，编码区长1497 bp，共编码498个氨基酸，它是构成病毒核衣壳的主要蛋白成分，在病毒基因组的转录和复制以及决定病毒的宿主特异性方面都具有重要的作用。同时，核蛋白在病毒蛋白中相对保守，是流感病毒A、B、C型划分的依据和诊断基础[12]。2012年，我们在江苏省南京市分离到了1株亚型犬流感病毒，其HA、NA和NP基因序列均显示与我国流行的H3N2亚型CIV具有最高的亲缘性，将其命名为A/Canine/Nanjing/11/2012（H3N2）[13]。本研究原核表达了该毒株的NP基因，并将其表达纯化后制备了多克隆抗体血清。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 T4 DNA连接酶、EcoRⅠ和HindⅢ、DNA Marker、IPTG和DNA凝胶回收试剂盒均购自TaKaRa公司；含有犬流感病毒A/Canine/ Nanjing/11/2012（H3N2）株NP基因（GenBank登录号:KF322107）的重组克隆质粒pMD18-NP由本实验室构建和保存[13]；pET-28a(+)、菌种E.coli DH5α和E.coli Rosetta（DE3）均购自Invitrogen公司；Ni-NTA His-Bind Resin购自Novagen公司；DAB显色液购自武汉博士德生物工程有限公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗犬IgG抗体由本试验室制备和保存[14]；CIV阳性血清为自然感染H3N2亚型CIV发病犬的血清。

1.2 引物设计 设计扩增NP基因引物，并添加酶切位点EcoRⅠ和Hind III，使之能够正确克隆到pET28a（+）表达载体中，且下游引物中缺失掉NP基因的终止密码子，从而使NP基因下游能与His标签融合表达以提高纯化效率，以上引物由上海Invitrogen公司合成。NP-F:5'-CAGAATTCATGGCGTCTCAAGG CACCPCR-3'（下划线为EcoRⅠ）；NP-R:5'-GC CAAGCTTCATTGTCATACTCCTCTGC-3'（下划线为Hind III）。

1.3 NP基因原核表达质粒的构建 以克隆质粒pMD18-NP为模板，用PCR方法扩增CIV的NP基因。反应条件:94℃预变性3 min；94℃变性1 min，55℃退火50 s，72℃延伸1.5 min，共30个循环；最后72℃延伸10 min。回收NP基因的PCR扩增产物，将其与原核表达载体pET-28a(+)分别用EcoR Ⅰ与Hind III双酶切，酶切片段纯化回收后用T4 DNA连接酶进行连接，转化E.coli DH5α感受态细胞，培养后提取重组质粒，用EcoRⅠ和Hind III双酶切，经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，获得重组表达质粒pET-NP。

1.4 原核表达质粒的诱导表达 将原核表达质粒pETNP分别转化宿主菌E.coli BL21（DE3）和E.coli Rosetta（DE3），挑取单克隆接种于LB培养基中，37℃、200 r/min振摇培养至菌液OD600为0.8时，加入诱导剂IPTG至终浓度1 mmol/L，37℃诱导培养4 h。离心收集菌体，经超声波裂解后离心，将菌体、裂解上清和沉淀进行SDS-PAGE分析。同步设立E.coli BL21（DE3）、E.coli Rosetta（DE3）和pET28a (+)转化菌培养物做对照。

1.5 重组NP蛋白的免疫原性分析 将诱导表达菌体蛋白经10% SDS-PAGE分离，转印到硝酸纤维素膜（NC膜）上，采用50 g/L脱脂奶粉4℃封闭过夜，封闭结束后，用PBS冲洗3次；以犬CIV阳性血清（1∶100）为一抗，37℃作用30 min，用PBS冲洗3次；HRP标记的兔抗犬IgG（1∶1000）为二抗，37℃作用30 min，用PBS冲洗3次；DAB底物显色，进行Western blot检测。

1.6 重组NP蛋白的纯化 大肠杆菌表达的重组NP蛋白主要以包涵体的形式存在。因此，将诱导培养的重组菌以10 800×g 离心15 min，用平衡缓冲液（含8 mol/L尿素、250 mmol/L咪唑的PBS缓冲液）4℃溶解包涵体并超声裂解至澄清，4℃、10 800×g离心30 min，收集上清，按Ni-NTA His-Bind Resin使用说明书方法纯化表达的重组NP蛋白。紫外分光光度计测定蛋白浓度，并用SDS-PAGE测定蛋白纯度。

1.7 抗NP蛋白多克隆抗体的制备 将纯化的重组NP蛋白以1 mg/只的剂量免疫大白兔。首次免疫用等体积弗氏完全佐剂乳化抗原，以后每隔14 d用弗氏不完全佐剂乳化抗原，进行免疫。5免后d 7心脏采血分离血清，按步骤1.5进行Wertern blot分析。以纯化的重组NP蛋白为包被抗原，采用方阵方法建立间接ELISA试验，测定所制备抗NP蛋白多克隆抗体血清的抗体效价。

2 结果

2.1 重组表达质粒pET-NP的构建与鉴定 PCR扩增CIV的NP基因阅读框后，用1%琼脂糖凝胶电泳分析，出现约1500 bp的DNA片段，与CIV的NP基因的理论值（1497 bp）相符合。将NP基因与原核表达载体pET28a（+）连接，构建重组表达质粒pET-NP，经EcoRⅠ与Hind III双酶切，可得到约1500 bp的NP基因片段和5000 bp的pET28a(+)表达载体片段，与预期大小DNA片段相符合（图1）。

2.2 原核表达质粒的诱导表达 将pET-NP转化的重组菌pET-NP/E.coli BL21（DE3）和pET-NP/E.coli Rosetta（DE3）分别诱导表达后，用SDS-PAGE分析，在分子量约61 kDa处均出现一特异条带。CIV的NP基因全长1497 bp，编码498个氨基酸，加上pET28a（+）表达载体的氨基酸序列，其NP蛋白分子量的理论值为61.6 kDa，两者相符，而空载体pET28a（+）作为对照均未出现此目的条带。Western blot分析显示两种宿主菌表达的目的蛋白均能够与犬CIV阳性血清发生特异性反应，表明表达产物具有较好的抗原反应性（图2、3）。比较图2和图3中的目的蛋白条带，重组质粒pET-NP在E.coli Rosetta （DE3）中的NP蛋白表达量明显高于E.coli BL21 （DE3）。

图1 重组质粒pET-NP酶切鉴定结果Fig.1 Identifi cation of the recombinant plasmid pET-NP by restriction digestionM∶ DNA分子量标准(DL5000); 1∶ NP基因; 2∶ 重组质粒pET-NP双酶切结果M∶ DNA Marker(DL5000); 1∶ NP; 2∶ Recombinant plasmid pETNP digested by EcoRⅠand Hind III

图2 pET-NP/E.coli BL21 (DE3) 重组菌的SDS-PAGE和Western blot分析结果Fig.2 Analysis of the expressed recombinant NP protein in E.coli BL21 (DE3) by SDS-PAGE and Western blotM∶ 低分子量蛋白质标准; 1∶ 诱导后的E.coli BL21 (DE3); 2∶ 诱导后的pET-NP/E.coli BL21 (DE3) 重组菌; 3∶ 诱导后的pET-NP/ E.coli BL21 (DE3) 重组菌的Western blot结果M∶ Protein Marker; 1∶ E.coli BL21 (DE3); 2∶ pET-NP/ E.coli BL21 (DE3） induced with IPTG; 3∶ Induced pET-NP/ E.coli BL21 (DE3) in Western blot

图3 pET-NP/E.coli Rosetta (DE3) 重组菌的SDS-PAGE和Western blot分析结果Fig.3 Analysis of the expressed recombinant NP protein in E.coli Rosetta (DE3) by SDS-PAGE and Western blotM∶ 低分子量蛋白质标准; 1∶ 诱导后的E.coli Rosetta (DE3)；2∶ 诱导后的pET-NP/E.coli Rosetta (DE3) 重组菌; 3∶ 诱导后的pET-NP/E.coli Rosetta (DE3) 重组菌的Western blotM∶ Protein Marker; 1∶ E.coli Rosetta (DE3) after induction; 2∶pET-NP/E.coli Rosetta (DE3) after induction; 3∶ Induced pETNP/E.coli Rosetta (DE3) in Western blot

图4 重组NP蛋白的纯化结果Fig.4 SDS-PAGE and Western blot result of the expressed and purifi ed recombinant NP proteinM∶ 低分子量蛋白质标准; 1∶ 诱导后的pET-NP/E.coli Rosetta (DE3) 重组菌的超声破碎上清液; 2～6∶ 纯化的重组NP蛋白, 浓度分别为0.5、1.8、0.5、0.2、0.1 mg/mL; 7∶ 纯化的重组NP蛋白的Western blotM∶ Protein Marker; 1∶ Lysate of pET-NP/E.coli Rosetta(DE3) after induction; 2-6∶ Purifi ed recombinant NP protein, and the concentrations were 0.5, 1.8, 0.5, 0.2, 0.1 mg/mL respectively; 7∶Purifi ed recombinant NP protein in Western blot

2.3 重组NP蛋白的纯化 将超声破碎的pET-NP/E.coli Rosetta(DE3) 菌液上清用SDS-PAGE分析，结果见图4。表达产物在上清中含量较高，说明重组NP蛋白主要以可溶形式存在于菌体内。将超声后的菌液上清采用Ni-NTA His·Bind Resin亲和层析纯化，5倍柱体积的Elution buffer洗脱，分别收集洗脱液。SDS-PAGE电泳结果显示纯化后的蛋白条带单一，分子量大小均为61 kDa，蛋白浓度依次为0.5、1.8、0.5、0.2、0.1 mg/mL。

2.4 抗NP蛋白多克隆抗体的制备 大量诱导表达目的蛋白NP并经镍柱纯化后，与佐剂混合乳化免疫大白兔，免疫5次后采血分离血清。Western blot检测结果表明，制备的抗NP蛋白多克隆抗体血清可以与纯化的重组NP蛋白发生特异性反应，在约61 kDa处出现1条特异性的蛋白带，与SDS-PAGE的分析结果一致。以纯化的犬流感病毒为包被抗原，建立间接ELISA试验，采用方阵试验方法确定抗原包被浓度为14 μg/mL，检测犬血清的稀释浓度为1∶200。用建立的间接ELISA试验对制备的抗NP蛋白多克隆抗体血清进行检测，其抗体效价可达1∶ 30 000，具有较高的抗体效价。

3 讨论

A型流感病毒是人类、鸟类和低等哺乳动物的重要病原体。近年来，许多不同亚型的流感病毒在犬体内被广泛地检测到[15-17]，犬流感病毒受到越来越多的关注。现已证实在中国和韩国出现的H3N2亚型犬流感病毒能在犬群中有效传播和传染，2015年初美国芝加哥5000只犬发生H3N2亚型犬流感疫情，表明该亚型犬流感病毒显示出不断扩大的趋势[10]。此外，流感病毒的重配事件往往容易引起流感的大流行，2012年韩国报道从犬体内分离到1株由H3N2亚型犬流感病毒HA基因和2009年甲型H1N1流感病毒其他7个基因片段重配的H3N1亚型犬流感病毒重配株[18]。犬与人类接触密切，犬流感病毒HA基因与人流感病毒的重配可能会增加人际间流感的流行，CIV可能对人类健康造成危害或隐患。因此，建立一种能够检测不同亚型流感病毒的快速检测方法，对犬进行系统有效的流感流行病学监测，具有重要的公共卫生意义。

流感病毒检测的常用方法为病毒的分离鉴定和血清学方法。流感病毒散毒周期短，有些临床症状不明显，给病毒的分离带来困难，病毒分离周期也较长。血清学调查可采用间接血凝抑制（HI）试验，该方法依赖于流感病毒表面的糖蛋白的血凝性，但其表面糖蛋白存在较高的抗原变异性[19]。CIV的NP蛋白相对保守，可用于不同亚型犬流感病毒的检测，主要用于各种ELISA诊断试剂盒中。我们前期从南京市宠物医院具有呼吸道症状的犬群中分离到1株H3N2亚型CIV，其NP基因与H3N2亚型犬流感病毒中国毒株具有较高的同源性和亲缘关系[13]，因此本研究选择当地流行株的NP蛋白进行原核表达，并制备抗NP蛋白多克隆抗体血清。

利用大肠杆菌表达重组蛋白，具有周期短、成本低、易于纯化等优点。pET表达系统是一种方便有效的原核表达系统，因此选用pET28a（+）原核表达载体构建了pET-NP重组表达质粒。由于选用E.coli BL21（DE3）宿主菌进行表达时蛋白表达量较低，同时我们发现此NP基因中有较多稀有密码子，因此选用了具有定向改善稀有密码子的表达限制性质的E.coli Rosetta（DE3）作为受体菌，提高了NP蛋白基因在大肠杆菌中的表达水平。为了提高重组NP蛋白的纯化效率，设计下游引物时对NP基因的终止密码子进行了缺失，使表达的重组NP蛋白的上游和下游均含有载体的His标签。通过Western blot和间接ELISA方法检测证实重组NP蛋白仍然保持了较好的抗原性，在免疫学检测和诊断实验技术中具有较为广泛应用前景。

综上所述，本研究成功表达了H3N2亚型CIV的NP蛋白，并制备了兔抗CIV NP蛋白多克隆抗体血清，为建立CIV NP蛋白ELISA抗原检测方法和抗体检测方法以及研究NP蛋白的结构与功能奠定了良好的基础。

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EXPRESSION AND CHARACTERIZATION OF RECOMBINANT NUCLEOPROTEIN OF H3N2 SUBTYPE CANINE INFLUENZA VIRUS

(Ministry of Agriculture National Center for Engineering Research of Veterinary Bio-products, Key Laboratory of Veterinary Biological Engineering and Technology, Institute of Veterinary Medicine, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China)

The nucleoprotein (NP) gene of H3N2 subtype Canine infl uenza virus (CIV) A/Canine/Nanjing/11/2012(H3N2) isolated from Nanjing, China, was cloned into pET-28a(+) for generation of a recombinant plasmid pET-NP. The resulting recombinant pET-NP was then transformed into E.coli Rosetta(DE3) competent cells following by induction with IPTG. The expression of the NP protein was detected in SDS-PAGE and Western blot. The results showed that the recombinant NP was 61 kDa protein corresponding to the expected molecular mass and reacted with the antiserum against H3N2 subtype CIV. The recombinant NP of CIV was purifi ed via Ni-NTA affi nity chromatography and the polyclonal antibodies were produced by immunizing rabbits with purifi ed recombinant NP. Western blot indicated that the polyclonal antibodies specifically recognized the recombinant NP. The polyclonal antibodies were titrated in indirect ELISA using the purifi ed recombinant NP as the coating antigen and the titer was as high as 1∶30 000. The availability of the recombinant NP and polyclonal antibodies laid a foundation for development of rapid detection and epidemiological methods for CIV.

Canine infl uenza virus; H3N2 subtype; nucleoprotein; prokaryotic expression; polyclonal antibody

S852.659.5

A

1674-6422（2017）01-0001-06

2016-04-26

江苏省农业科技自主创新资金项目（CX（15）1065）

王晓丽，女，硕士，副研究员，主要从事新型兽用疫苗与检测试剂盒研究

王永山，E-mail:wangys63@126.com

WANG Xiao-li, BI Zhen-wei, WANG Yong-shan, PAN Qun-xing, OUYANG Wei, XIA Xing-xia, ZHU Yu-mei