人IL-37b在大肠埃希菌中的表达、纯化及活性鉴定

李梦媛，韦荣飞，徐大模，杨星九，高 苒

(中国医学科学院医学实验动物研究所，北京 100121)

研究报告

人IL-37b在大肠埃希菌中的表达、纯化及活性鉴定

李梦媛，韦荣飞，徐大模，杨星九，高 苒*

(中国医学科学院医学实验动物研究所，北京 100121)

目的 表达重组IL-37b蛋白并去除内毒素，鉴定其活性。方法 构建原核表达载体pET28/IL-37b，转化大肠杆菌感受态细胞；经IPTG诱导表达的重组蛋白由Ni2+-NTA凝胶进行变性条件下的亲和层析纯化；用SDS-PAGE分析、考马斯亮蓝染色鉴定重组蛋白是否为目的蛋白；去除蛋白中原核表达所产生的内毒素；将蛋白作用于受LPS刺激的RAW 264.7细胞，收集培养上清，通过ELISA方法检测IL-6的表达水平，鉴定蛋白的生物学活性。结果 表达了纯度较好的重组IL-37b蛋白，降低了其中原核表达所产生的内毒素，经鉴定其具备良好的生物学活性。结论 成功表达了具备良好生物学活性的IL-37b蛋白。

IL-37b；表达；纯化；生物学活性

IL-37是IL-1家族细胞因子，最初被发现时被命名为IL-1F7[1]，目前是IL-1家族中唯一一个没有在小鼠体内发现有同类分子的细胞因子[2]。IL-37的基因包含6个外显子，其编码产物有a、b、c、d、e共5种亚型，其中，外显子1～3编码IL-37前体蛋白的N末端，外显子4～6编码C末端IL-1样细胞因子结构[3]。IL-37b是五种亚型中序列最长的一个，共有218个氨基酸，含有外显子1、2、4、5、6；其序列在N端有一段前导序列，其中存在一个caspase-1切割位点，IL-37b前体分子经caspase-1切割修饰后成为成熟分子移入细胞核[4,5]。近年来，大量研究已证实IL-37b具有生物学活性，其能够作为炎症抑制因子抑制多种免疫细胞的炎症反应，进而调节固有免疫应答，IL-37b对外源性刺激诱导的结肠炎、关节炎、胰腺炎等多种炎症性疾病中都能够发挥抗炎作用[6-11]。

目前，国外已有商品化的IL-37b蛋白，但价格比较昂贵，商品包装量较少。本实验通过成本较低廉、操作较便捷的技术手段大量表达IL-37b蛋白，并对其生物学活性进行了鉴定，为进一步研究IL-37b在相关炎症性疾病中的机制提供了条件。

1 材料和方法

1.1 材料

含有全长IL-37b编码区基因的质粒pGEM-T-IL-37b以及表达载体由本实验室保存，大肠杆菌DH5α购自天根生物公司，Taq聚合酶、限制性内切酶、pET28a(+)质粒等购自Takara公司，质粒提取试剂盒购自Qiagen公司。Ni2+-NTA凝胶购自Novagen公司，透析袋购北京自亮蓝生物公司，尿素、Tris-Cl、NaH2PO4、考马斯亮蓝等化学试剂购自Amresco公司。内毒素去除和检测试剂盒购自金斯瑞生物公司，IL-37抗体购自Abcam公司，HRP标记的山羊抗兔IgG购自中杉金桥生物公司。RAW 264.7细胞购自中国医学科学院基础医学研究所，LPS(Lipopolysaccharide)购自Sigma公司，ELISA试剂盒购自R&D公司，96孔酶标板购自COSTAR公司，预染蛋白分子量marker与BCA蛋白浓度检测试剂盒购自Thermo公司。引物合成服务由英潍捷基(上海)公司提供，DNA序列测定服务由北京美吉生物提供。

1.2 方法

1.2.1 IL-37b基因的克隆与表达载体的构建

IL-37b基因模板来自本实验室制备的含IL-37b全长编码区基因的质粒pGEM-T-IL-37b。以质粒pGEM-T-IL-37b为模板，通过PCR技术对IL-37b编码区基因进行扩增。上游引物F1：5’-GGAATTCCA TATGTCCTTTGTGGGGGAGAAC-3’(下划线为NdeI酶切位点)；下游引物F2：5’-CGGAATTCCTA ATCGCTGACCTCACTGGGGCTC-3’(下划线为EcoRI酶切位点)。PCR反应条件为：94℃ 3 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s；扩增30个循环后，72℃延伸5 min。采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，并进行胶回收，收集扩增的目的基因片段，用于连接构建表达载体。用限制性内切酶EcoRI和NdeI分别对目的基因的PCR产物与表达载体pET28a(+)进行双酶切，再次进行琼脂糖凝胶电泳，通过胶回收纯化收集酶切产物，于室温过夜连接，构建表达载体。将连接产物转化大肠杆菌DH5α，取100 μL转化液均匀涂布于具有卡那霉素抗性的LB平板，于37℃培养箱中倒置培养。次日，挑选菌落进行PCR，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定结果后，将阳性克隆进行DNA测序鉴定，检测IL-37b基因片段是否正确插入，阳性克隆质粒命名为pET28/IL37b。

1.2.2 重组蛋白的表达与纯化

转化重组质粒pET28/IL-37b进入大肠杆菌感受态细胞后，将其均匀涂布于具有卡那霉素抗性的LB平板上，于37℃培养箱中倒置培养过夜。次日，挑取单个菌落接种至3～4 mL LB液体液体培养基中，进行少量培养。将培养的菌液按1∶500的体积比接种到更多LB液体培养基中，进行37℃，200 r/min振摇培养，每隔一段时间检测菌液OD600值。培养至菌液OD600值达到0.5～0.6时，加入终浓度1 mmol/L的IPTG诱导菌体表达蛋白，继续37℃振摇培养。培养16～18 h后，以4℃，4000 r/min条件离心30 min，收集菌体沉淀。用PBS重悬沉淀，经超声破碎，12000 r/min再次离心20 min，分别取细菌裂解产物的上清与沉淀进行SDS-PAGE电泳，分析目的蛋白的表达形式[12]。电泳结果显示细菌裂解产物的上清和沉淀中都有外源性重组蛋白表达的条带，表明重组IL-37b具有可溶性和包涵体两种表达形式。由于沉淀中的目的重组蛋白较多，故再次实验时诱导表达1 L菌液，离心并超声破碎菌体后，收集其沉淀进行纯化。重组IL-37b蛋白带有6个His标签，采用Ni2+-NTA凝胶进行变性条件下的亲和层析纯化，变性结合缓冲液为8 mol/L尿素，0.1 mol/L NaH2PO4，0.01 mol/L Tris-Cl，pH 8.0；变性漂洗缓冲液为8 mol/L尿素，0.1 mol/L NaH2PO4，0.01 mol/L Tris-Cl，pH 6.3；变性洗脱缓冲液为8 mol/L尿素，0.1 mol/L NaH2PO4，0.01 mol/L Tris-Cl，pH 4.5；具体步骤按Merck的His Tag蛋白纯化操作手册进行。纯化完成后，通过PBS对重组蛋白进行透析复性，除去其中的尿素，于4℃环境透析24 h，每2～3 h更换一次透析液。

1.2.3 SDS-PAGE电泳与Western blot

配制12～15%的分离胶，将纯化蛋白过程中收集的各组溶液进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后，用考马斯亮蓝对电泳胶染色，至能明显观察到marker与蛋白条带后，用乙酸脱色液洗涤至条带清晰，于紫外显影仪下观察蛋白条带。另外对一块胶进行转膜，将蛋白条带电转至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭，按1∶1000的比例用IL-37抗体4 ℃孵育过夜。次日，用0.1%的PBST洗膜去除非特异性结合，加入1∶5000稀释的HRP标记的山羊抗兔IgG，洗膜后加显影液，观测蛋白条带。

1.2.4 去除重组蛋白内毒素并鉴定内毒素残留量

使用金斯瑞生物的内毒素去除试剂盒与内毒素检测试剂盒，通过凝胶吸附法除去重组蛋白溶液中的内毒素，并检测去除内毒素后蛋白中内毒素残留量。

去除内毒素前调节蛋白溶液pH至6.0～9.0之间，以达到更好的去除效果。首先使用3～4倍柱体积的再生缓冲液活化柱中的内毒素吸附树脂，控制流速在0.25 mL/min，确保体系内无热原；随后用3～4倍柱体积的平衡缓冲液平衡树脂，流速控制在0.5 mL/min；开始去除内毒素，加入样品，流速控制在0.25 mL/min，用无热原接收管收集流出液；柱子经再生后可重复使用或4 ℃保存。

用试剂盒中的无热源水溶解鲎变形细胞溶解物(limulus amebocyte lysate，LAL)检测蛋白溶液中的内毒素含量。按1∶50～1∶3200梯度稀释重组蛋白样品；分别将0.1 mL的LAL溶液与同体积的蛋白样品混匀，37℃孵育1 h，观察LAL与蛋白样品是否凝固成胶状物质。按样品的稀释倍数计算内毒素含量，若其含量达不到预期要求，可对柱中树脂进行再生，再次去除内毒素。

1.2.5 重组蛋白生物学活性的鉴定

采用0.05～200 ng/mL不同浓度梯度的重组蛋白与终浓度1 μg/mL LPS共同作用于RAW 264.7细胞，37℃培养细胞24 h后，收集培养上清，通过ELISA方法检测上清中IL-6的表达量。步骤如下，提前1 d在96孔板上包被捕获抗体，室温过夜。次日弃去旧液，用0.05%的PBST洗涤3次，用1% BSA室温封闭1 h。弃去旧液，洗涤后加入收集的细胞培养上清样品与稀释好的标准品，室温封闭2 h。弃去旧液，洗涤后加入检测抗体，室温封闭2 h。弃去旧液，洗涤后加入HRP，避光室温孵育20 min。弃去旧液，洗涤3次，加入按体积比1∶1混合的显色液A液与B液，避光孵育10～20 min，随后加入终止液终止显色反应。通过酶标仪检测450 nm波长处的OD值，按照OD值绘制标准曲线，并通过其方程计算样品中IL-6表达量。

2 结果

2.1 表达载体的构建与鉴定

PCR扩增产物在500 bp左右有一条符合预期结果的目的基因条带，如图1所示；质粒经EcoRI、NdeI双酶切后，在500 bp左右处也有一条与目的基因大小相符的条带。DNA测序结果与BLAST分析显示PCR扩增出的片段无碱基突变；构建的表达质粒pET28/IL-37b，通过菌落PCR鉴定阳性克隆，扩增出的基因片段同样在500 bp处，也与预期结果相符。对阳性克隆进行DNA测序，结果显示IL-37b基因片段正确插入表达载体pET28a(+)质粒中，碱基无突变，可进一步用于目的蛋白的诱导表达。

注：1：IL-37b基因的PCR产物；2：pET28a/IL-37b质粒经Nde I/EcoR I双酶切的结果。图1 琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR与酶切产物Note. 1: PCR Results of IL-37b gene; 2: Result of pET28/IL-37b by Nde I/EcoR I digestion.Fig.1 Identification of PCR and dual-enzyme digestion products by agarose gel electrophoresis

2.2 重组蛋白的表达与鉴定

SDS-PAGE电泳结果如图2所示，经IPTG诱导后，菌液在25 kDa左右处有一条与预期相符合的高表达外源性蛋白条带，与预期蛋白的相对分子量相符合；纯化后的蛋白中除一条目的条带外未见其他条带；Western Blot结果显示诱导表达的重组IL-37b能够与相应的IL-37抗体产生特异性结合，其条位置正确，大小相符[6,13]，而未经IPTG诱导的菌液裂解产物的Western Blot结果则没有相应的条带。经检测从1 L大肠杆菌培养液的菌体沉淀中共纯化得到约40 mg左右的重组IL-37b蛋白。

注：1：未经IPTG诱导的菌体裂解液；2：经IPTG诱导的菌体裂解液；3：经IPTG诱导的菌体裂解液沉淀；4：纯化后的IL-37b；5：未经IPTG诱导的菌体蛋白的Western blot结果；6：重组IL-37b的Western blot结果。图2 IL-37b纯化的SDS-PAGE分析以及Western blot鉴定Note. 1: Total cell lysates before IPTG induction; 2: Total cell lysates after IPTG induction; 3: IPTG-induced cell lysate precipitation; 4: Purified IL-37b protein; 5: Western blot analysis of bacterial proteins before IPTG induction; 6: Western blot for recombinant IL-37b protein. Fig.2 SDS-PAGE and Western blot analysis of the purified IL-37b

2.3 去除重组蛋白内毒素并鉴定内毒素残留量内毒素检测试剂

盒中LAL的灵敏度为0.25 EU/mL，计算公式：内毒素含量=0.25 × 样品稀释倍数/样品浓度。经公式计算去除内毒素后重组IL-37b的内毒素残留量范围大约在0.04～0.07 EU/μg范围内。(见表1)

表1 重组IL-37b中的内毒素残留量

注：“+”：样品凝固；“-”：样品未凝固。

Note. “+”：The sample solidified；“-”：The sample was not solidified.

2.4 重组蛋白生物学活性的鉴定

用RAW 264.7细胞检测重组IL-37b对LPS刺激的抑制作用。如图3所示，重组IL-37b在0.05～200 ng/mL时均能够抑制LPS刺激引起的IL-6的表达；且蛋白浓度在10～200 ng/mL时与LPS对照组相比差异显著，表明以此种方式诱导表达的IL-37b具有良好的生物学活性。

注：与LPS对照组比较，*P < 0.05；**P < 0.01。图3 IL-37b对LPS刺激RAW264.7细胞IL-6表达量的影响Note. Compared with the LPS control group，*P < 0.05；**P < 0.01.Fig.3 Effect of IL-37b on IL-6 production on LPS stimulated RAW 264.7 cells

3 讨论

本实验通过原核表达的方式大量生产包涵体形式的IL-37b蛋白，随后复性使其恢复生物学活性。SDS-PAGE电泳结果显示经变性纯化的IL-37b中基本无其他杂蛋白条带；Western blot结果显示重组IL-37b能够与相应的IL-37抗体产生特异性结合，其条带清晰，大小正确，与文献报导相符[6,13]。证明通过本实验的纯化方式能够快捷、大量地得到纯度较好的IL-37b。

LPS系革兰阴性菌细胞壁外表层的内毒素脂多糖，在细菌死亡细胞受到破坏后释放。LPS性质稳定，耐高温，能够引起发热、微循环障碍、内毒素休克等症状[14]。实验中，通过凝胶吸附法去除了重组IL-37b样品中的大部分内毒素，降低了IL-37b在发挥治疗与免疫功能的过程中对细胞、机体产生的毒副作用，也减小了将其应用于其他实验研究时产生的误差。

细菌、病毒感染以及IL-1、TNF-α等细胞因子均可诱导正常细胞产生IL-6，IL-6能够刺激参与免疫反应的细胞增殖、分化并提高其功能，如诱导Th17细胞分化、B细胞抗体表达等，是机体炎症反应的标志性细胞因子之一[15]。本实验中，通过ELISA方法检测RAW 264.7细胞中IL-6的表达量，以此检测重组蛋白对促炎性细胞因子的抑制作用。RAW 264.7细胞系小鼠来源的单核巨噬细胞，自身不表达IL-37，避免了对实验的背景干扰[2]；重组IL-37b在0.05～200 ng/mL时均能在不同程度上抑制LPS刺激引起的IL-6的表达；且蛋白浓度低至10 ng/mL时，其IL-6的表达量与LPS对照组相比仍存在显著差异，证明表达的IL-37b经纯化后具备良好的生物学活性。

目前，商品化IL-37蛋白包装量较少，价格昂贵，有些不具备生物学活性，只能在某些实验中作为对照品使用。本实验成功制备了纯度较好、内毒素含量低并具备良好生物学活性的IL-37b，为今后进一步研究IL-37b在人类各种疾病中发挥的机制提供条件。

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Expression, purification and activity assay of human IL-37b inE.coli

LI Meng-yuan，WEI Rong-fei，XU Da-mo，YANG Xing-jiu，GAO Ran*

(Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences & Comparative Medicine Center，Peking Union Medical College，Beijing 100021，China)

Objective To investigate the expression of recombinant IL-37b protein and removal of the endotoxin, and identify its biological activity. Methods The prokaryotic expression vector pET28/IL-37b was constructed and to transformEscherichiacoli(E.coli) Rosetta. After induction with IPTG, the recombinant protein was purified through Ni2+-NTA gel column and identified by SDS-PAGE and Coomassie brilliant blue staining. Then, the endotoxin protein was removed and was treated with LPS-stimulated RAW 264.7 cells. The culture supernatant was collected. The expression of IL-6 was detected by ELISA and the biological activity of the protein was identified.Results The recombinant IL-37b with high purity was expressed and the endotoxin produced by prokaryotic expression was reduced, and it was identified to have good biological activity. Conclusions In this study a recombinant IL-37b protein with high biological activity is successfully obtained.

IL-37b; Expression; Purification; Biological activity

中央级公益性科研院所基本科研业务费。

李梦媛(1988-)，女，研究方向：免疫学。E-mail：limengyuan767@126.com

高苒(1980-)，女，研究方向：肿瘤学、免疫学。E-mail：gaoran26@hotmail.com

R-33

A

1671-7856(2017) 03-0020-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.03.004

2016-08-26