碳量子点荧光猝灭法测定饮料中日落黄

苏安梅， 钟青梅， 余姝轶， 覃 秀， 王益林

(广西大学化学化工学院 广西生物炼制重点实验室， 广西 南宁 530004)

碳量子点荧光猝灭法测定饮料中日落黄

苏安梅， 钟青梅， 余姝轶， 覃 秀， 王益林*

(广西大学化学化工学院 广西生物炼制重点实验室， 广西 南宁 530004)

以柠檬酸为碳源制备碳量子点(CQDs)，所得碳量子点被394 nm的光激发后在484 nm处有较强的荧光发射，最大吸收波长为482 nm的日落黄能强烈猝灭碳量子点的荧光。基于该现象，发展了一种以碳量子点为荧光探针测定日落黄的分析方法，并探讨了荧光猝灭机理。在选定的实验条件下，该分析方法的线性检测范围为0.1～100 μmol/L，检出限(3σ/k)为0.051 μmol/L。

碳量子点； 荧光猝灭； 日落黄

1 引 言

食用色素是食品添加剂成员之一，包括天然色素和合成色素两大类。与天然色素相比，合成色素具有性质稳定、着色力强及价格低廉等优势，被广泛应用于食品工业中。但合成色素对人类健康存有潜在危害，世界各国对合成色素的使用种类、使用范围及用量均进行了严格的规定，我国也不例外。日落黄是常用的食用合成色素之一，过量食用会引起过敏、腹泻等症状，严重时甚至会引起肝损伤与肾衰竭。为确保食品安全，对生产、加工过程中日落黄的监测及产品中日落黄的含量进行定量测定具有重要意义。

国家标准方法(GB/T5009.35-2003)对食品中日落黄含量的检测采用的是高效液相色谱法和薄层色谱法。此外，检测食品中日落黄的其他方法还有毛细管电泳法[1]、酶联免疫分析法[2]、分光光度法[3]及电化学法[4]等。在众多分析方法中，采用荧光法测定日落黄的研究比较少见[5-6]。碳量子点是一种新型荧光探针，已广泛应用于化学分析[7-8]和生物传感[9-10]等研究领域。本文制备了发射光谱与日落黄吸收光谱重叠的碳量子点，建立了一种基于碳量子点荧光猝灭测定饮料中日落黄含量的新方法。

2 实 验

2.1 主要试剂

柠檬酸(99.0%，广州化学试剂厂)；日落黄(87%，阿拉丁化学试剂有限公司)；柠檬黄(85%，阿拉丁化学试剂有限公司)；抗坏血酸(分析纯，广东光华科技股份有限公司)；六偏磷酸钠、苯甲酸钠、山梨酸钾(分析纯，阿拉丁化学试剂有限公司)；麦芽糖、乳糖、葡萄糖、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸(分析纯，天津市大茂化学试剂厂)。佳得乐和健力宝饮料购自南宁市某超市。

2.2 实验步骤

2.2.1 碳量子点的制备

碳量子点的制备按照文献[11]方法进行：将装有5.0 g柠檬酸的烧杯置于已升温到200 ℃的恒温干燥箱中加热30 min，取出后用1 mol/L的NaOH溶液将其pH值调至7.0，然后转移到250 mL容量瓶中并定容。

2.2.2 日落黄的测定

在系列25 mL比色管中依次加入2.0 mL碳量子点溶液、15.0 mL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH=8.0)和不同体积的日落黄标准溶液(浓度为500 μmol/L)，用二次去离子水定容到刻度后充分混匀。取适量溶液于比色皿中，用RF-5301型荧光分光光度计测荧光强度(I)，同时做日落黄试剂空白，荧光强度值记为I0。测定时，激发波长选用394 nm，激发和发射狭缝分别设置为10.0 nm和5.0 nm。

3 结果与讨论

3.1 pH值对碳量子点荧光强度的影响

在系列25 mL比色管中各加入2.0 mL碳量子点溶液、15.0 mL不同pH值的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，然后用去离子水定容到刻度，以考察碳量子点在不同pH环境下的荧光发射特性。图1表明，体系的pH值对碳量子点的荧光强度有强烈的影响。pH=3时，碳量子点的荧光较弱；随着pH的升高，荧光迅速增强；当pH>7.0时，荧光强度值趋于稳定。

图1 缓冲液pH值对碳量子点荧光光谱的影响

Fig.1 Influence of buffer pH values on the fluorescence spectra of CQDs

3.2 日落黄对碳量子点荧光的选择性猝灭

分别取2.0 mL 碳量子点加入到相同浓度(100 μmol/ L)的下列物质溶液中：日落黄(SY)、六偏磷酸钾(SHMP)、山梨酸钾(Potassium sorbate)、苯甲酸钠(Sodium benzoate)、柠檬酸(CA)、蔗糖(Sucrose)、乳糖(Lactose)、葡萄糖(Glc)、柠檬酸钠(Na-Citrate)、麦芽糖(Maltose)、维生素C(VC)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、氯化钾(KCl)，并用pH=8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液定容到25 mL刻度，分别测定这些溶液的荧光强度，以考

图2 碳量子点在不同物质溶液中的相对荧光强度,各物质的浓度均为100 μmol/L。

Fig.2 Relative fluorescence intensity of CQDs in different species, the concentration of species are all 100 μmol/L.察不同物质对碳量子点荧光光谱的影响。结果如图2所示。图2数据表明，日落黄能有效猝灭碳量子点的荧光，而其他物质则几乎没有响应。进一步研究表明，日落黄对碳量子点的荧光猝灭程度随浓度的升高而增强(图3)。日落黄可以猝灭碳量子点荧光的实验事实表明，以碳量子点为荧光探针对溶液中日落黄进行定量测定是可行的。

图3 日落黄浓度对碳量子点荧光光谱的影响,从上到下日落黄浓度依次为0,10，30，50 μmol/L。

Fig.3 Fluorescence spectra of CQDs in the presence of sunset yellow. From top to bottom, the concentrations of sunset yellow are 0, 10, 30, 50 μmol/L, respectively.

3.3 日落黄的测定

3.3.1 测定条件的选择

与文献[12]报道一样，本文制备的碳量子点的荧光发射波长也随激发波长的变化而变化。我们认为产生这一现象的原因可能与碳量子点的粒度分布比较宽有关。一定波长的光激发一定粒度的碳量子点发射一定波长的荧光。光谱测量表明，本实验制备的碳量子点在394 nm光的激发下具有最强的荧光发射，荧光光谱的最强发射峰位于484 nm处，而日落黄的最大激发波长是303 nm，在394 nm光的激发下没有荧光(图4)。因此，本实验所用激发光波长为394 nm。

图5为碳量子点及碳量子点-日落黄体系在不同pH条件下的荧光强度。可以看出，二者的荧光强度都随pH值的升高而上升，最后保持稳定不变。当pH值在7.0～8.0范围内时，量子点荧光猝灭程度最大。本文选择在pH=8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中进行实验。

图6是碳量子点及碳量子点-日落黄体系在不同时间间隔下的荧光强度。数据表明，在碳量子点溶液中加入日落黄后会立即引起荧光猝灭，在60min内，体系的荧光强度非常稳定。本文选择在60 min内完成全部测试。

图4 在394 nm激发下，碳量子点(CQDs)和日落黄(SY)的荧光光谱。

Fig.4 Fluorescence spectra of CQDs and SY solution under 394 nm excitation

图5 不同pH值条件下添加与未添加日落黄时的碳量子点的荧光响应

Fig.5 Fluorescence responses of CQDs in the absence and presence of sunset yellow at different pH values

图6 pH=8.0、日落黄浓度为10 μmol/L时，不同反应时间下的碳量子点的荧光响应。

Fig.6 Fluorescence responses of CQDs in 10 μmol/L SY solution with pH=8.0 at different reaction time

当体系的荧光强度很高时，少量日落黄的加入使荧光的猝灭程度很小，分析的灵敏度低；当体系的荧光较弱时，少量日落黄的加入使荧光的猝灭程度较大，灵敏度高，但线性范围窄[13]。为兼顾线性和范围灵敏度，本文选择在25 mL比色管中加2.0 mL碳量子点，定容到刻度后进行荧光测定。

3.3.2 共存物的影响

在选定的实验条件下，考察了多种共存物对10 μmol/L日落黄测定结果的影响。当相对误差在±5%范围内时，允许的共存物倍数为：500倍的蔗糖、果糖、乳糖、葡萄糖、麦芽糖；300倍的甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、赖氨酸、苏氨酸；5倍的柠檬黄。数据表明，该方法具有较好的选择性。

3.3.3 方法的线性范围、检出限和精密度

根据实验方法，测定了碳量子点在不同浓度日落黄溶液中的荧光光谱。在选定的实验条件下，日落黄浓度在0.1～100 μmol/L范围内与体系相对荧光强度的对数值呈良好的线性关系(图7)。线性回归方程为log(I0/I) =9.1×10-3C+0.056 (C为日落黄的浓度，单位：μmol/L)，相关系数为0.993，方法检出限(3σ/k)为0.051 μmol/L。对含10 μmol/L 日落黄的溶液连续测定5次，测定结果的相对标准偏差为3.6%，说明该方法的灵敏度和精密度较高。

a～q：C(sunset yellow)=0, 0.1, 0.2, 0.3, 1, 4, 10, 14, 16, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 100 μmol/L

图7 日落黄浓度对碳量子点荧光光谱的影响。插图： Log(I0/I)与日落黄的浓度在0.1～100 μmol/L范围内成良好的线性关系。

Fig.7 Fluorescence response of various concentrations of sunset yellow in pH=8 buffer solution. Inset shows the linear relationship between log(I0/I) and sunset yellow concentration within the range of 0.1-100 μmol/L, pH=8.0.

3.3.4 分析应用

将市售的液体饮料样品通N2除去其中的CO2，分别取1.0 mL置于已加入2.0 mL碳量子点溶液的比色管中，用缓冲溶液(pH=8.0)定容到25 mL刻度后测其荧光强度。同时按实验方法做工作曲线，根据工作曲线求得各试液中日落黄的浓度，并进一步计算出在样品中的含量，所得结果见表1。数据表明，所测饮料中日落黄的含量低于0.1 g/kg，符合食品添加剂卫生标准(GB2760- 2011)。在所测样品中分别加入不同浓度的日落黄标准溶液，进行加标回收率实验。表1数据表明，平均回收率在98.5%～103%之间，说明该方法的准确度很高。

表1 饮料中日落黄的测定结果

3.4 碳量子点荧光猝灭机理探讨

荧光猝灭可通过电荷转移或能量转移等多种方式进行。电荷转移猝灭是猝灭剂与荧光物质的激发态分子之间发生电荷转移而引起的，能量转移猝灭是荧光分子(供体)所发射的荧光被猝灭剂(受体)吸收而引起的。只有当供体的发射光谱与受体的吸收光谱重叠时才能发生能量转移猝灭[14]。本实验所用碳量子点在394 nm光激发下的最大发射波长为484 nm，而日落黄的最大吸收波长位于482 nm处，二者的光谱有很大部分重叠(图8)。因此，我们认为碳量子点的荧光猝灭是因能量转移所致。

图8 日落黄(SY)吸收光谱与碳量子点发射光谱的重叠

Fig.8 Overlap of absorption spectra of sunset yellow and fluorescence spectra of carbon quantum dots

4 结 论

以柠檬酸为碳源制备了水溶性碳量子点。基于碳量子点发射光谱与日落黄吸收光谱相重叠而发生能量转移的原理，发展了一种碳量子点荧光猝灭测定日落黄含量的分析方法并应用于饮料样品的测定，测定结果令人满意。本研究既拓展了碳量子点的应用范围，又为日落黄的测定提供了一种新方法，其准确度、精密度能满足饮料中日落黄色素测定的要求。

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苏安梅(1992-)，女，广西百色人，硕士研究生，2015年于广西大学获得学士学位，主要从事量子点荧光材料的合成与应用的研究。

E-mail: 962240842@qq.com 王益林(1968-)，男，湖南邵阳人，博士，副教授，2010年于广西大学获得博士学位，主要从事量子点荧光材料的合成与应用的研究。

E-mail: theanalyst@163.com

Fluorescence Quenching Method for Determination of Sunset Yellow in Drinks with Carbon Quantum Dots

SU An-mei, ZHONG Qing-mei, YU Shu-yi, QIN Xiu, WANG Yi-lin*

(GuangxiKeyLaboratoryofBiorefinery,SchoolofChemistryandChemicalEngineering,GuangxiUniversity,Nanning530004,China)*CorrespondingAuthor,E-mail:theanalyst@163.com

Water-soluble carbon quantum dots (CQDs) were prepared by using citric acid as carbon source. The obtained CQDs showed a strong emission at the wavelength of 484 nm, with an optimum excitation of 394 nm. Sunset yellow with maximum absorption wavelength at 482 nm could selectively quench the fluorescence of CQDs. Based on this principle, a fluorescent probe was developed for sunset yellow determination. Furthermore, the quenching mechanism of the CQDs was elucidated. A linear relationship was found in the range of 0.1-100 μmol/L sunset yellow with the detection limit (3σ/k) of 0.051 μmol/L. Satisfactory results were achieved when the method was submitted to the determination of sunset yellow in liquid samples.

carbon quantum dots; fluorescence quenching; sunset yellow

1000-7032(2017)04-0530-05

2016-10-27；

2016-11-24

广西自然科学基金(2014GXNSFAA118328)； 广西生物炼制重点实验室开放基金(GXKLB-2)； 广西大学大学生创新创业训练计划(201610593162)资助项目 Supported by Natural Science Foundation of Guangxi Province(2014GXNSFAA118328); Open Fund of Key Laboratory of Biorefinery of Guangxi(GXKLB-2); Innovation and Entrepreneurship Training Program of Guangxi University(201610593162)

O611.4

A

10.3788/fgxb20173804.0530