表面增强拉曼光谱研究胞嘧啶在银胶上的吸附行为

聂永惠， 李 盼， 刘文涵， 滕渊洁

(浙江工业大学化学工程学院 绿色化学合成技术国家重点实验室培育基地， 浙江 杭州 310032)

表面增强拉曼光谱研究胞嘧啶在银胶上的吸附行为

聂永惠， 李 盼， 刘文涵*， 滕渊洁*

(浙江工业大学化学工程学院 绿色化学合成技术国家重点实验室培育基地， 浙江 杭州 310032)

为探讨胞嘧啶(Cytosine，Cy)在基底银表面的吸附特性和规律，采用表面增强拉曼散射(SERS)光谱对其吸附行为进行分析，并结合量子化学密度泛函理论(DFT)/B3LYP计算方法对Cy分子的常规拉曼光谱(NRS)及Cy与Ag团簇吸附的SERS光谱进行计算，与测定结果进行比对且对其拉曼峰进行系统指认及归属，理论计算结合实测值探讨了Cy在基底Ag上的增强效应和吸附行为。考察了Cy分子在Ag纳米粒子上的不同吸附时间、浓度、pH等条件对SERS光谱的影响及优化，发现pH影响最大，在中性和强碱性条件下的增强效应明显优于酸性。Cy分子存在2种不同的异构体和3种不同的存在形态，并随酸度变化相互转化而达动态平衡。基于Cy在不同pH时的形态分布和相应的SERS变化规律，结合DFT算得的Cy分子中的电荷分布及在银基底表面的吸附机制，详细探讨了酸碱对Cy分子的SRES光谱影响的内因和吸附机理，指出在中性和弱碱性时，是Cy中的N3和O与Ag形成配位吸附；在pH大于11时，N与Ag形成配位吸附，而O与Ag形成共价吸附。

胞嘧啶； 表面增强拉曼光谱； 吸附行为； DFT

1 引 言

拉曼光谱是鉴别和分析物质结构的重要方法之一，具有快速、无损检测特点。表面增强拉曼光谱(SERS)凭借其高探测灵敏度、对分子振动具有指纹式分辨的特点，通过分析样品的拉曼峰位、峰强、线型、线宽及谱线数目达到从分子水平对样品进行定性、定量和结构的分析。SERS是研究分子在基底上行为、揭示分子与基底表面的作用机制和吸附分子在表面取向的有力手段[1-2]。

核酸(DNA)是生物体内重要的遗传物质，DNA碱基是揭示这些遗传信息的钥匙，其排列组合是生物体遗传、进化、变异的根本原因，因此碱基一直是生物和化学领域的重要研究内容之一，对碱基分子性质的研究有助于研究生物体行为以及生物活性。胞嘧啶作为DNA的基本单元之一，在DNA紫外损伤而导致皮肤和其他疾病的过程中起决定性作用[3]，李敏杰等[4]利用密度泛函理论(DFT)和极化连续介质模型研究了DNA上鸟嘌呤-胞嘧啶(G-C)碱基对氧化损伤的反应机理。近年来，有对DNA及其碱基如胞嘧啶和鸟嘌呤及其他生物分子相互作用[5]拉曼光谱的研究，以及胞嘧啶与金电极相互作用[6-7]的报道，但未见采用DFT计算与拉曼光谱及SERS对其吸附行为进行深入研究。本文结合量子力学的DFT和在不同酸碱下胞嘧啶SERS光谱的变化规律，着重从分子水平探讨胞嘧啶在银基底表面的吸附本质及吸附机理。

2 实 验

2.1 试剂与仪器

LabRAM HR UV 800激光显微拉曼光谱仪，购自法国JOBIN YVON公司。激发光源为632.81 nm He-Ne激光器，激发功率为17 mW，激光照射在样品表面的功率为4.57 mW，分辨率为2 cm-1。50倍长焦距物镜为德国Leica公司产品。

胞嘧啶(>99%)，购自Aldrich试剂公司。Tris-HCl缓冲溶液的浓度为50 mmol·L-1，pH=7.4。硝酸银、柠檬酸三钠(C6H5NaO7·2H2O)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、盐酸等试剂均为分析纯及以上。实验用水为18.3 MΩ·cm的超纯水。

2.2 实验方法

2.2.1 银胶的制备

采用化学氧化还原法制备银胶纳米颗粒。银胶的制备参考Lee和Meisel[8]的方法，将其置于粽色广口瓶中密闭于4 ℃低温避光储存备用。基底使用前需对其进行处理：在离心机中以1 000 r·min-1转速离心10 min，离心后弃上层透明清液，再滴入去离子水，超声震荡5 min，使纳米粒子重新分散，重复洗涤2次，再离心弃上层清液，得到浓度较大、纯度较高的溶胶[9]。

2.2.2 NRS与SERS测试

拉曼仪器参数设置：扫描范围为200～4 000 cm-1，光谱信号采集时间为30 s，积分2次平均。用Tris-HCl缓冲液配制浓度为1.0×10-4mol·L-1胞嘧啶溶液作为储备液。再稀释成不同浓度梯度的胞嘧啶溶液，以及用0.1 mol·L-1的H2SO4或NaOH调节配制不同pH的胞嘧啶溶液。检测时，取胞嘧啶溶液与纳米银溶胶基底以体积比1∶1混合，静置15 min，使银溶胶基底聚集，并使待测物分子充分吸附分布在纳米粒子表面，再进行SERS测试。

2.2.3 理论计算

量化计算在对结构优化和频率分析中，采用DFT在B3LYP/6-31++G(d, p) (C，H，N)/Lanl2dz(Ag)水平上，分别对胞嘧啶及胞嘧啶与不同数量Ag原子的团簇复合物进行模拟计算，得到相应结构的拉曼光谱和结构图形，并借此对胞嘧啶的振动光谱进行归属指认。

3 结果与讨论

3.1 银纳米粒子的透射电镜表征

用透射电子显微镜(TEM)对所合成的银纳米粒子进行了表征，如图1所示。从图中可以直接观察到纳米粒子形状及粒径分布。银纳米粒子的形貌以球形及椭圆形为主，平均粒径为54 nm，其粒径主要集中分布在40～60 nm范围内。这说明银纳米粒子的粒径分布比较均一和集中，能够满足拉曼增强实验对基底均匀性和一致性的要求。

图1银纳米粒子的TEM图像

3.2 胞嘧啶分子理论优化结构及电荷布局

图2 胞嘧啶分子结构(a)及依据B3LYP/6-31++G (d, p)计算得到的表面静电势映射图(b)

Fig.2 Molecular structure of cytosine(a) and the molecular electrostatic potential mapping of cytosine on surfaces calculated at the B3LYP/6-31++G(d, p) level(b)

3.3 胞嘧啶分子理论光谱的计算及对比

为明确胞嘧啶的拉曼峰谱归属，我们通过密度泛函理论杂化泛函B3LYP计算得到理论拉曼光谱，并对Cy的Raman光谱图与实际测得的NRS、SERS图谱进行对比，如图3所示。可以看出，实测的主要特征峰与理论值基本一致，但某些谱峰也有一定的偏差，这是由于理论计算本身的误差所致。

为进一步考察Cy分子与Ag原子作用的SERS，我们选择单个的Ag、三角形的Ag3及Ag5团簇对Ag与Cy组合成的Cy—Ag、Cy—Ag3、Cy—Ag5复合物进行了模拟计算拉曼光谱，其结果和振动模式的指认一并列于表1。整体来看，Cy—Agn(n=1,3,5)复合物的主要特征峰计算值较Cy计算值要更接近于SRES实测结果。这是由于Cy与银团簇Agn之间的相互作用会导致电荷再分配增加了静态电子极化[12]，更类似于Ag纳米基底的多原子表面，从而更接近于SERS实测环境。

图3 胞嘧啶的拉曼光谱图：a-Cy理论计算谱;实测谱图：b-NRS;c-SERS。

Fig.3 Raman spectra of cytosine.a:Calculated. b:Experimental NRS.c:Experimental SERS.

3.4 胞嘧啶拉曼振动模式指认

表1 胞嘧啶的实测拉曼特征峰与理论计算值及其归属

Tab.1 Comparison of the experimental and theoretical Raman spectra in frequencies (cm-1) and assignments of cytosine cm-1

MeasuredvaluesCalculatedvaluesNRSSERSCyCy—AgCy—Ag3Cy—Ag5Vibrationalassignments251ν(Ag—N[10]),ν(Ag—Cl[11])403430357370383377β(C4—NH2)472396405416410ρ(N1—H)549561544553551554β(N3=C4—C5),β(C2—N1—C6)599600577586590587β(N1—C2—N3),β(C4—C5=C6)793798768773781778Ringbreathing924939955951ω(—NH2),ν(C4—C5),ν(N1—C2)974952960955967964γ(—C6—H),γ(C5—H)110910409889951000999β(C4—C5—C6),β(C2—N3—C4),ω(—NH2)1087110411101108ω(—NH2),β(N1—C2—N3)125111931128113211311130β(N1—H),β(C5—H)1219122711291228β(N1—H),β(C6—H)127713071264126312781272ν(C2—N3),ν(N3—C4),ν(N1—C2)136313551358137613781373γ(C5—H),γ(N1—H),ν(C4—NH2)14311443145914521452β(C2—N3—C4),ν(C4—C5),β(N1—H)146114781507151715221516νs(—NH2),ν(C4—NH2)15391570156815621563τ(N3—C4—C5),γ(N1-H),ν(C2O)15801637166616481648νs(—NH2)165516291691169616891689ν(N3—C4),ν(C5—C6),ν(C2O)16901774178717681772ν(C2—O),γ(—N1—H)312330883212320032243222γ(—N1—H),γ(—C6—H)3235322032463244γ(—C5—H)

Symbols:ν: Stretching vibration;νs: Symmetric stretching vibration;νas: Asymmetric stretching vibration;δ: Scissoring vibration;β:Bending in-plane;γ: Bending out-of-plane;ω: Wagging;ρ:Rocking;τ:Twisting.

3.5 吸附反应时间与SERS的关系

考察每间隔3 min胞嘧啶溶液在银表面吸附作用后的SERS信号，其SERS测定结果如图4所示。图5为789，1 307 cm-1峰强度随吸附反应时间的关系图。可以看出，在15 min内，SERS的峰强随吸附反应时间的延长而增大，到15 min时达到最大，之后趋于平稳。这是由于胞嘧啶分子在溶液中迁移扩散到银溶胶表面进行吸附需要时间，随着吸附分子的增加，SERS增强，在一定时间后达到吸附脱附的动态平衡；另一方面，与待测溶液混合后的纳米银粒子会随时间的延长而聚集，使SERS信号增强。可见，应该在吸附反应时间15 min后再进行检测。

图4 胞嘧啶与纳米银胶混合后不同吸附时间的SERS光谱图(C(Cy)=1×10-4mol·L-1，pH=7.46)。(a)0 min;(b)3 min;(c)6 min;(d) 9 min;(e)12 min;(f)15 min;(g)18 min.

Fig.4 SERS spectra of mixture system of cytosine with silver colloid at different mixed time.(a) 0 min. (b) 3 min. (c) 6 min. (d) 9 min. (e) 12 min. (f) 15 min. (g) 18 min.

图5 胞嘧啶SERS峰强与吸附时间的关系

Fig.5 Peak intensity of 798 cm-1and 1 307 cm-1vs. adsorption time

3.6 不同胞嘧啶浓度与SERS的关系

图6 不同胞嘧啶溶液浓度的SERS光谱(pH=7.46，t=15 min)

Fig.6 SERS spectra of cytosine with different concentrations

图7 胞嘧啶的798，1 307，1 629 cm-1特征峰强与浓度的关系。

Fig.7 SERS peak intensity of 798，1 307，1 629 cm-1vs. concentration of cytosine.

3.7 不同溶液的pH值对胞嘧啶SERS的影响

为考察溶液酸度对胞嘧啶分子SERS的影响，测定了浓度为1×10-4mol·L-1时的不同pH值下的SERS光谱，如图8所示。可以看出，随着pH值的变化，峰强度发生了明显的改变，在pH=6.00～12.00的范围内，561，600，798，1 040，1 193 cm-1等特征峰的相对强度明显增大，而1 307，1 431，1 629，3 088 cm-1这4个峰则先增强后下降。图9为胞嘧啶的798，1 040，1 193，1 307，1 431，3 088 cm-1等特征峰强度与不同pH值的关系图。

图8 不同pH值时的胞嘧啶分子的SERS光谱(1×10-4mol·L-1)

Fig.8 SERS spectra of cytosine at different pH (1×10-4mol·L-1)

从图9可以看出，随着pH值的改变，SERS信号基本呈3段变化：pH=6以下基本为弱信号，pH=6～11为随pH增加而上升阶段，pH>11为达到最大值后的逐渐减弱阶段。值得探讨的是1 307，1 431，3 088 cm-1峰信号(图9 b，e，f)的特殊走势，这几个峰随着pH的增加先扬后抑，与其他键的拉曼信号的增强形成了鲜明的对比。

图9 胞嘧啶798，1 040，1 193，1 307，1 431，3 088 cm-1特征峰强与pH的关系。

Fig.9 SERS peak intensity of 798，1 040，1 193，1 307，1 431， 3 088 cm-1vs. pH value.

3.8 Cy在不同pH值下的存在形式及与SERS的关系

图10 胞嘧啶分子在溶液中随pH变化的形态转变

Fig.10 Morphological changes of cytosine molecules in different pH solution

Cy的酸碱解离常数pKa1和pKa2为4.60和12.16[15]，设溶液中Cy分子3种结构形态的总浓度为1，可以得到Cy在不同pH时的形态分布[16](图11)。从图11中可以看出，在pH<3.6时，胞嘧啶主要以Cy+存在(δA>90%)；酸性减弱(pH增加)时，Cy+开始失去H+向Cy±的形式转化，在pH为4.6时，Cy+与Cy±均占50%；随着pH值的继续升高，在5.6～11.1的范围内，溶液主要以Cy±态存在(δB+δB′>90%)；pH>11.1后，Cy±逐渐向Cy-转变，δC所占比例逐渐增大。

图11 胞嘧啶分子在不同pH下的形态分布图

结合图9、10、11，考察不同pH值下的Cy分子结构及SERS信号的变化。SERS强度变化呈3个不同的阶段，与不同pH条件下胞嘧啶形态变化相对应。在酸性较强条件下(pH<6.75)，随酸性的增强，胞嘧啶分子的SERS信号逐渐消失。在pH=6.10～11.04的范围内，Cy分子主要以中性Cy±存在，798，1 040，1 193 cm-1等峰呈逐渐增强的正趋势。在pH>11.04后，798，1 040，1 193 cm-1峰强反而有略微下降趋势。这些现象表明溶液pH的改变与Cy分子结构的改变以及SERS拉曼光谱的变化呈一定的相关性。

3.9 Cy在Ag表面吸附机理的探讨

图12 胞嘧啶分子在纳米银溶胶上的吸附示意图。(a) 中性条件下；(b)碱性条件下。

Fig.12 Schematic diagram of adsorption of cytosine adsorption on Ag nanoparticle. (a) Neutral condition. (b) Alkaline condition.

4 结 论

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聂永惠(1992-)，男，湖南涟源人，硕士研究生，2014年于北方民族大学获得学士学位,主要从事仪器分析、表面增强拉曼光谱的痕量分析和量子化学计算方面的研究。

E-mail: nieyonghui@zjut.edu.cn滕渊洁(1983-)，女，浙江台州人，博士，讲师，2011年于华东理工大学获得博士学位，主要从事表面增强拉曼光谱的痕量分析、电化学-表面增强拉曼光谱联用表面分析、光电小型快速检测分析方面的研究。

E-mail: yuanjieteng@zjut.edu.cn刘文涵(1956-)，男，江苏无锡人，教授，1986年于杭州大学(今浙江大学)获得硕士学位，主要从事仪器分析、原子分子光谱分析、激光拉曼光谱、电化学分析测试及在线联用检测等的研究。

E-mail: liuwh@zjut.edu.cn

Adsorption Behavior of Cytosine on Silver Colloid Investigated by Surface Enhanced Raman Scattering

NIE Yong-hui, LI Pan, LIU Wen-han*, TENG Yuan-jie*

(StateKeyLaboratoryBreedingBaseofGreenChemistry-SynthesisTechnology,CollegeofChemicalEngineering,ZhejiangUniversityofTechnology,Hangzhou310032,China)*CorrespondingAuthors,E-mail:liuwh@zjut.edu.cn;yuanjieteng@zjut.edu.cn

The adsorption characteristics and regularity of cytosine (Cy) on the silver substrate surface were analyzed by the means of surface enhanced Raman scattering (SERS) combing with quantum chemistry density functional theory (DFT). The normal Raman spectrum (NRS) of Cy and Cy—Agncomplex (n=1, 3, 5) SERS spectra were calculated by DFT/B3LYP method, which were further compared with the measured results to identify and assign the spectral peaks. The SERS spectra of Cy molecules on silver colloid nanoparticles were recorded at different adsorption time, concentration and pH. The results show that pH value has the greatest influence on its SERS signal, especially at neutral and strong alkaline conditions. It is inferred that there are two different isomers of Cy molecules and three kinds of existing forms, and all of them keep dynamic balance in the solution. The adsorption mechanism of Cy on the surface of silver substrate was further discussed in detail based on the morphological distribution of Cy at different pH by their corresponding SERS changes combining with the DFT calculation of charge distribution in Cy molecules. In conclusion, the N3and O in Cy are coordinated to Ag at the neutral and weakly alkaline conditions. N and Ag form coordinated adsorption and O and Ag form covalent adsorption, when the pH is greater than 11.

cytosine; surface-enhanced Raman scattering; adsorption behavior; DFT

2016-10-27；

2017-01-23

浙江省自然科学基金(LQ17B050002)； 浙江省公益性技术应用研究(分析测试)计划(2015C37068)资助项目 Supported by Natural Science Foundation of Zhejiang Province(LQ17B050002); Analysis and Measurement Foundation of Zhejiang Province(2015C37068)

1000-7032(2017)04-0543-09

O657

A

10.3788/fgxb20173804.0543