绿原酸对人白血病阿霉素耐药株K562/ADM细胞多药耐药的影响及其机制

任秀敏，贾秀红，朱聪，段培锋(滨州医学院附属医院，山东滨州 256603)



绿原酸对人白血病阿霉素耐药株K562/ADM细胞多药耐药的影响及其机制

任秀敏，贾秀红，朱聪，段培锋
(滨州医学院附属医院，山东滨州 256603)

目的 观察绿原酸对人白血病阿霉素耐药株K562/ADM细胞多药耐药的影响，进一步探讨其作用机制。方法 取对数生长期的人白血病细胞株K562细胞和K562/ADM细胞，将不同浓度(2～64 μmol/L))的绿原酸作用于K562/ADM 细胞24 h后，采用MTT法检测绿原酸内在细胞毒性及对阿霉素(Adr)的增敏作用，并计算逆转倍数；流式细胞术检测经绿原酸处理后K562/ADM 细胞内Adr和罗丹明123平均荧光强度;Western blotting法检测细胞多药耐药相关蛋白(MRP1)、P糖蛋白(P-gp)、t-Akt、p-Akt蛋白表达。结果 筛选出细胞抑制率<10%时的绿原酸浓度为4 μmol/L以内，即为无毒剂量。绿原酸2、4 μmol/L及Adr作用K562/ADM细胞后的逆转倍数分别为1.65、2.21倍。K562/ADM细胞内Adr平均荧光强度为184±22，用2、4 μmol/L绿原酸处理K562/ADM细胞，加入Adr后，其荧光强度分别为223±26、326±35，绿原酸干预前后荧光强度比较，P均<0.05。绿原酸干预K562/ADM后细胞内MDR1、p-Pg、t-Akt、p-AKT蛋白表达受抑(P均<0.05)，2、4 μmol/L绿原酸处理K562/ADM细胞24 h后，MRP1、P-gp、p-Akt蛋白相对表达量分别为(77.34±1.143)%、(59.63±0.658)%、(37.41±0.575)%和(66.12±1.102)%、(51.33±0.658)%、(32.41±0.575)%。结论 绿原酸体外可有效逆转K562/ADM细胞多药耐药，其相关分子机制可能通过下调P13K/Akt信号通路抑制MRP1、P-gp蛋白表达实现。

白血病；绿原酸；多药耐药；K562/ADM细胞

白血病占所有恶性肿瘤的4%，目前治疗的主要手段仍是化疗，但由于多药耐药(MDR)的产生，白血病5年生存率仅为50%，因此，逆转MDR是白血病治疗中亟待解决的问题[1]。绿原酸是由咖啡酸与奎尼酸形成的缩酚酸，是植物在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的苯丙素类化合物，具有抗氧化、抑菌、抗炎、降糖、免疫调节等多种功效[2]。近年研究发现，绿原酸能抑制乳腺癌、结直肠癌、肝癌等肿瘤细胞的生长[3～6]，但绿原酸是否具有逆转白血病MDR功能，目前尚不明确。2015年10月，我们体外观察绿原酸对人慢性髓系白血病细胞阿霉素耐药株K562/ADM MDR的逆转作用，并分析相关作用机制，为绿原酸与其他化疗药物联合治疗白血病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料绿原酸(纯度>98%，大连美仑生物技术有限公司),人慢性髓系白血病细胞株K562(滨州医学院中心实验室)，人慢性髓系白血病细胞阿霉素耐药株K562/ADM (中国医学科学院血液学研究所)，RPMI1640培养基、胎牛血清(美国Hyclone公司)，四甲基唑蓝(MTT，美国Sigma公司)，用PBS配成5 g/L、4 ℃避光保存，罗丹明123(Rhl23，华美公司)，二甲基亚砜(DMSO，美国Gibco公司)，阿霉素(Adr，北京博奥森生物技术有限公司)，兔抗多药耐药相关蛋白(MRP1)、P糖蛋白(P-gp)、t-Akt、p-Akt、GADPH多克隆抗体(美国Abcam公司)。

1.2 耐药倍数测定 采用MTT法。将K562、K562/ADM细胞置于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、链霉素的RPMI1640培养基中，培养于37 ℃、5%CO2、饱和湿度的无菌培养箱，每2～3 d传代1次，用4 μg/mL的Adr维持K562/ADM细胞的耐药性，实验开始前1周用不含Adr的RPMI1640培养基进行常规培养。取对数生长期的K562细胞和K562/ADM细胞，接种于96孔板，每孔细胞数均为4×103/孔，分别加入不同浓度Adr(K562细胞：0.2～3.2 mg/L，K562/ADM细胞：8～128 mg/L)，每个浓度设5个平行复孔，另设空白组(未加药)，放于37 ℃、5%CO2、饱和湿度的无菌培养箱培养24 h后，每孔加入MTT(5 g/L)20 μL溶液培育4 h，4 ℃平板离心机离心10 min后，弃上清，每孔加入DMSO 150 μL，避光振荡裂解15 min后，于570 nm波长处检测各孔吸光度(A)值。计算半数抑制浓度(IC50)和耐药倍数(耐药倍数=耐药细胞株IC50/敏感细胞株IC50)，独立重复实验3次。

1.3 绿原酸无毒剂量的筛选 取对数生长期的K562/ADM细胞，随机分为实验组与对照组，接种于96孔培养板中，细胞数4×103/孔，实验组加入不同浓度的绿原酸(2、4、8、16、32、64 μmol/L)100 μL，对照组予等量RPMI1640培养基,培养24 h后，测570 nm波长处的A值。计算绿原酸各个浓度下的细胞抑制率：细胞抑制率(IR)=[1-(实验组A均值/对照组A均值)]×100%，筛选出细胞抑制率<10%时的绿原酸浓度，即为无毒剂量。独立重复实验3次。

1.4 逆转耐药倍数检测 采用MTT法。K562/ADM细胞接种和培养方法同1.2，每孔加入不同浓度的Adr(2、4、8、16、32 μg/mL)，分单用Adr组，Adr与不同浓度绿原酸(2、4 μmol/L)合用组，MTT法测定吸光度(A)值。计算逆转倍数，逆转倍数=单用Adr IC50/Adr与绿原酸合用IC50。

1.5 Adr胞内蓄积实验 参考文献[7,8]方法，取对数生长期K562/ADM细胞，调整细胞浓度2×105/mL，随机分为四组，K562/ADM组、K562/ADM+Adr组、K562/ADM+绿原酸(2 μmol/L)+Adr组、K562/ADM+绿原酸(4 μmol/L)+Adr组加入相应浓度药物,接种于6孔板，置于37 ℃、5%CO2无菌培养箱中避光培育1 h，加入终浓度为3 mg/L Adr，继续培养1 h后，用冷PBS洗涤2次除去游离Adr，用流式细胞仪检测细胞内Adr激发的平均荧光强度,激发波长485 nm，发射波长585 nm，以相对荧光强度表示Adr浓度。独立重复实验3次。

1.6 P-gp功能检测 采用罗丹明蓄积和外排实验，对照组加入终浓度为2 mg/L 罗丹明123(Rh123)，实验组在对照组基础上分别加入浓度为2、4 μmol/L的绿原酸，放于37 ℃、5%CO2培养箱中避光孵育1.5 h后，冷PBS洗涤2次除去游离Rh123，流式细胞仪测定细胞内Rh123被激发的相对荧光强度(激发波长485 nm，发射波长535 nm)，以平均荧光强度(MFI)表示Rh123浓度。独立重复实验3次。

1.7 MRP1、P-gp、t-Akt，p-Akt表达检测 采用Western blotting法。取对数生长期K562/ADM细胞，5×105/孔接种于6孔板，不加或加不同浓度(2、4 μmol/L)的绿原酸培养24 h后，提取细胞总蛋白，煮蛋白后取50 μg进行电泳，转膜，用7.5%的脱脂奶粉封闭2 h后，TBST洗膜，加1∶200稀释的兔抗人多克隆抗体P-gp、MRP1、p-Akt及1∶500稀释的兔抗人多克隆抗体GADPH，置4 ℃摇床过夜，用化学发光试剂显色，使用Chemiscope 软件分析图像，MRP1、P-gp、t-Akt、p-Akt蛋白的相对表达量用MRP1、P-gp、t-Akt、p-Akt灰度值/GADPH灰度值表示。独立重复实验3次。

2 结果

2.1 K562/ADM细胞的耐药倍数 K562、K562/ADM细胞经Adr处理24 h后，IC50分别为(1.68±0.79)、(61.38±2.23)μmol/L，与敏感株K562细胞相比，耐药株K562/ADM细胞对Adr的杀伤作用表现出明显的耐受性，耐药倍数为36.54倍。

2.2 筛选出的绿原酸无毒剂量 绿原酸在所有测试剂量下对K562/ADM细胞的生长抑制作用呈剂量依赖性，浓度为2 μmol/L生长抑制率<5%,浓度为4 μmol/L生长抑制率<10%。筛选出细胞抑制率<10%时的绿原酸浓度为4 μmol/L以内，即为无毒剂量。

2.3 绿原酸对K562/ADM细胞耐Adr的逆转倍数 相同Adr浓度剂量下，与绿原酸合用后，Adr对K562/ADM耐药株的细胞抑制作用提高，Adr对耐药白血病细胞的毒性增强，且增强效果与绿原酸呈浓度依赖性。K562/ADM + Adr组、K562/ADM+绿原酸(2 μmol/L)+ Adr组、K562/ADM +绿原酸(4 μmol/L)+ Adr组IC50分别为(55.98±2.31)、(32.54±1.48)、(25.38±0.98)μmol/L，K562/ADM +绿原酸(2 μmol/L)+ Adr组、K562/ADM+绿原酸(4 μmol/L)+Adr组逆转倍数分别为1.65、2.21倍。

2.4 细胞内Adr激发的平均荧光强度比较 K562细胞内Adr平均荧光强度明显高于K562/ADM细胞，K562/ADM细胞内Adr平均荧光强度为184±22。用2、4 μmol/L绿原酸处理K562/ADM细胞，加入Adr后，其荧光强度分别为223±26、326±35，2、4 μmol/L绿原酸可显著增加K562/ADM细胞内Adr蓄积，分别为对照组1.21和1.77倍，呈剂量依赖性。

2.5 P-gp功能变化 将K562/ADM与Rh123共同孵育后，K562/ADM细胞内Rh123荧光强度为513±18，绿原酸处理K562/ADM细胞，加入Rh123后，测定其荧光强度，分别为713±25、929±37，绿原酸各浓度(2、4 μmol/L)均可显著增加K562/ADM细胞内Rh123蓄积，分别为对照组的1.39、1.81倍，并呈剂量依赖性。

2.6 绿原酸干预后K562/ADM细胞MRP1、P-gp、p-Akt蛋白表达变化 绿原酸干预后细胞内MDR1、p-Pg、t-Akt、p-AKT蛋白表达受抑，绿原酸(2、4 μmol/L)处理K562/ADM细胞24 h后，MRP1、P-gp、p-Akt蛋白相对表达量分别为(77.34±1.143)%、(59.63±0.658)%、(37.41±0.575)%和(66.12±1.102)%、(51.33±0.658)%、(32.41±0.575)%。

3 讨论

白血病是严重威胁人类健康的恶性肿瘤，化学疗法为其治疗的重要手段，白血病细胞MDR的产生是导致化疗失败的主要原因[9]，探讨白血病的MDR相关机制并寻找有效的逆转剂有重要意义。中药毒性低，能与化疗药物联合使用，是近年国内研究的热点[10]。绿原酸存在于高等双子叶植物和蕨类植物中，具有广泛的药理作用。研究发现，绿原酸对乳腺癌、结直肠癌、肝癌具有抑制作用[3～6]，抗肿瘤作用逐渐被重视，但其是否能逆转白血病MDR尚不清楚。K562/ADM细胞株由逐步增加培养基中阿霉素浓度建立的人白血病耐药细胞株，能稳定表达P-gp。本实验结果显示，K562/ADM细胞经浓度为 2～64 μmol/L的绿原酸处理 24 h 后，细胞生长均不同程度受抑制，并呈剂量依赖性。用MTT法检测浓度分别为2、4 μmol/L 的绿原酸与阿霉素联合处理K562/A02细胞后，IC50明显下降，逆转倍数分别为1.65、2.21倍，胞内阿霉素和Rh123蓄积实验显示，2、4 μmol/L 的绿原酸能增加细胞内阿霉素、Rh123蓄积。上述结果提示绿原酸具有逆转白血病MDR的作用，但具体作用机制仍不明确。

目前研究表明，化疗药物外排增加是产生MDR的原因之一，其主要机制为ABC转运子表达增多，如P-gp、MRP1等[8，11]。P-gp位于细胞膜上，是由ABCBl(MDRl)基因编码的有机阳离子泵，能与蒽环类及鬼臼碱类药物等多种药物结合，以耗能方式主动将药物从细胞泵出，降低细胞内药物浓度，使其免受化疗药物的杀伤而产生耐药性；MRP1由MRP1基因编码，同P-gp具有结构相似性，亦具有将多种化疗药物由胞内转运至胞外的功能，与临床耐药有关[12]。P13K/Akt是细胞内重要的信号传导通路，在白血病MDR中发挥重要作用，研究发现，在肿瘤细胞中，高活化P13K/Akt信号通路通过上调ABC结合膜蛋白促进药物外排，尤其与P-gp和 MRP1密切相关，阻断PI3K/Akt信号通路导致下游P-gp和 MRP1表达下调，增强肿瘤细胞对化学药物的敏感性[13]。Rh123是P-gp特异性荧光底物，能间接反映化合物与P-gp结合活性及对P-gp功能抑制作用。我们将绿原酸与阿霉素联合处理K562/ADM细胞后，可增加Rh123在K562/ADM细胞内的蓄积，提示P-gp的外排功能受到抑制，继而采用Western blotting法在蛋白水平探究绿原酸对P-gp及MRP1表达的影响，结果显示联合处理后的K562/ADM细胞内P-gp蛋白和MRP1蛋白表达降低，p-Akt表达降低,提示绿原酸通过PI3K/Akt信号通路下调P-gp和MRP1表达。

综上所述，绿原酸能抑制K562/ADM细胞生长并逆转其MDR，作用机制可能是通过PI3K/Akt信号通路下调P-gp和MRP1表达实现。

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山东省自然科学基金资助项目(ZR2014HL032)；山东省医药卫生科技发展计划项目(2014WS0183)。

贾秀红(E-mail：jiaxiuhong001@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.25.014

R733.7

A

1002-266X(2017)25-0045-03

2016-11-06)