青蒿琥酯对人肺腺癌细胞系A549增殖的抑制作用及机制

马宏境，曾妮，黄少祥(天津市第五中心医院，天津300450)



青蒿琥酯对人肺腺癌细胞系A549增殖的抑制作用及机制

马宏境，曾妮，黄少祥
(天津市第五中心医院，天津300450)

目的 观察青蒿琥酯对人肺腺癌细胞系A549增殖的抑制作用，并探讨其作用机制。方法 常规培养A549细胞后，不同浓度(0、25、50、75、100 μmol/L)的青蒿琥酯作用A549细胞，采用CCK-8法检测青蒿琥酯对A549细胞的增殖抑制率，Western blotting法检测mTOR信号通路关键分子和自噬相关蛋白p62、LC3B表达变化。结果 25 μmol/L及以上浓度的青蒿琥酯可抑制A549细胞增殖，并呈时间和浓度依赖性(P均<0.05)。不同浓度(0、25、50、75、100 μmol/L)的青蒿琥酯作用A549细胞48 h可降低p62表达，增加LC3B表达，并降低mTOR信号通路关键分子的表达，并呈剂量依赖性。青蒿琥酯联合自噬抑制剂3-MA可增加A549细胞的生存率(P<0.05)。结论 青蒿琥酯可能通过下调mTOR信号通路关键分子表达、诱导A549细胞发生自噬从而抑制A549细胞增殖。

肺肿瘤；青蒿琥酯；细胞自噬；细胞增殖；雷帕霉素靶蛋白

青蒿琥酯是从黄花蒿叶中提取的单体成分[1]，能治疗疟疾，具有抗肿瘤的功效。研究表明，青蒿琥酯主要通过促进肿瘤细胞凋亡、产生氧化应激反应、减少局部肿瘤组织的血管形成、诱导细胞发生自噬反应及增强机体免疫力等途径发挥抗肿瘤作用[2～5]。多项研究表明，不同的试验条件下，自噬能促进细胞存活或抑制细胞生长[6～9]，因此，可通过调节自噬的发生及程度来促进人体正常细胞的存活，诱导肿瘤细胞死亡。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是细胞能量代谢研究领域一个重要调节靶点，位于PI3K/Akt信号通路的下游，在自噬调节中发挥重要作用[10]。mTOR能感知细胞内的营养状况，根据细胞内氨基酸和ATP含量的变化来调节细胞本身的自噬水平[11]。核糖体蛋白S6是mTOR复合物1(mTORC1)下游的主要效应分子，通过其表达变化能说明mTOR活性表达水平[12]。目前国内外研究多采用p62及微管相关蛋白1轻链3(LC3)作为自噬发生的分子标记物[13，14]。2015年6月～2016年6月，本研究观察了青蒿琥酯对人肺腺癌细胞系A549增殖的抑制作用，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 青蒿琥酯由广东新南方青蒿科技有限公司提供，用倍比稀释法调整药物浓度。人肺腺癌细胞系A549购于北京协和基础医学研究所细胞中心。胎牛血清购于Gibco公司；DMEM基础培养液购于美国Hyclone 公司；自噬抑制剂3-MA购于Sigma公司；β-actin抗体购于北京中杉金桥生物技术有限公司；S6、phospho-S6、LC3B、P62抗体购于Cell Signaling Technology公司，HRP-标记的羊抗鼠/兔购于Santa Cruz公司，Cell counting kit-8(CCK-8试剂盒)购于日本同仁化学研究所。

1.2 细胞培养 A549细胞于含10% FBS的DMEM培养基中培养，培养条件为37 ℃、5% CO2，饱和湿度。间隔48～72 h传代。

1.3 A549细胞增殖抑制率检测 采用CCK-8法。制备A549细胞悬液，调整细胞为3×107/L，置于96孔板，每孔100 μL。于培养24 h细胞完全贴壁后随机分为两部分。一部分随机分为5组，分别加入0、25、50、75、100 μmol/L青蒿琥酯100 μL；另一部分随机分为5组，分别加入0、25、50、75、100 μmol/L青蒿琥酯，同时加入3 mmol/L 3-MA，各组均设置10个复孔。分别作用24、48、72 h，用CCK-8试剂盒检测A549细胞存活情况。用酶标仪测量波长450 nm的吸光度值，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=[1-(AX-A)/(A0-A)]×100%。AX为加药孔OD值，A为未加细胞，单纯药物的OD值；A0为未加药物的OD值。青蒿琥酯IC50使用SPSS17.0软件进行计算。

1.4 细胞内mTOR信号蛋白S6、自噬特异性蛋白p62、LC3B蛋白表达检测 采用Western blotting法。取指数生长期的细胞，制成细胞悬液后接种于6孔板，培养24 h，饥饿处理12 h后分别加入0、25、50、75、100 μmol/L青蒿琥酯各100 μL，作用48 h提取总蛋白，用BCA法定量，检测样品加入5×上样缓冲液后煮沸10 min，根据蛋白定量结果调整每份样品蛋白上样量，进行上样。以β-actin为内参，SDS-PAGE电泳分离后，转膜至PVDF膜。室温条件下常规封闭1 h，加入一抗，于4 ℃条件下孵育过夜。用HRP标记二抗，室温条件下继续孵育1 h，经TBST洗涤后，ECL化学发光法检测蛋白表达。用Imagine J软件进行检测。蛋白相对表达量(校正后)=蛋白灰度值/内参灰度值。

2 结果

2.1 青蒿琥酯对A549细胞增殖的影响 经0、25、50、75、100 μmol/L青蒿琥酯单独作用24 h，A549细胞增殖抑制率分别为7.1%、15.0%、35.7%、46.3%、60.2%；作用48 h，A549细胞增殖抑制率分别为7.7%、20%、46%、53%、70%；作用72 h，A549细胞增殖抑制率分别为8.3%、25.0%、53.0%、55.7%、73.4%。A549细胞增殖抑制率随药物浓度的增加而增加、随作用时间的增加而增加。24、48、72 h青蒿琥酯的IC50分别为(46.2±5.4)、(75.0±6.7)、(124.4±5.6)μmol/L。经0、25、50、75、100 μmol/L青蒿琥酯与3-MA共同作用24 h，A549细胞增殖抑制率分别为7%、14.2%、34.9%、49.3%、62.2%；作用48 h，A549细胞增殖抑制率分别为7.5%、16.1%、40.7%、43.1%、62.0%；作用72 h，A549细胞增殖抑制率分别为8.0%、20.0%、48.9%、50.1%、65.7%。同时点同浓度的青蒿琥酯加入3-MA后，A549细胞增殖抑制率降低(P均<0.05)。

2.2 青蒿琥酯对mTOR信号蛋白S6活性的影响 经0、25、50、75、100 μmol/L青蒿琥酯单独作用48 h，结果显示，当药物作用浓度为25 μmol/L以上时，随着药物浓度的增加，p-S6蛋白相对表达量降低，S6蛋白表达水平不变，p-S6蛋白相对于S6蛋白表达量分别为1.41±0.12、1.40±0.09、1.25±0.11、1.02±0.07、0.70±0.06；差异有统计学意义(P均<0.05)。

2.3 青蒿琥酯对自噬特异性蛋白p62、LC3B表达的影响 经0、25、50、75、100 μmol/L青蒿琥酯单独作用48 h，p62蛋白相对于内参β-actin的相对表达量分别为0.98±0.10、0.81±0.08、0.70±0.06、0.64±0.04、0.57±0.04，LC3BⅡ/Ⅰ分别为0.43±0.05、0.78±0.09、1.22±0.11、1.59±0.14、1.98±0.17。与未加药物相比，p62表达随青蒿琥酯浓度增强而降低(P均<0.05)。LC3B表达增强，LC3BⅡ/Ⅰ值增加，LC3BⅠ向LCBⅡ转化增多，细胞自噬增强(P<0.01)。

3 讨论

研究表明，青蒿琥酯能在体外培养环境下抑制多种肿瘤细胞生长[15～17]。其机制可能为通过诱导细胞自噬来抑制肿瘤细胞生长[5]。自噬这种可导致细胞死亡的反应方式，在肺部肿瘤的基础研究领域逐渐受到重视。

本研究选取A549细胞为实验对象，观察青蒿琥酯对细胞自噬的诱导作用。自噬主要参与细胞的能量代谢，依赖于生存环境的不同来发挥对细胞的双向调节功能[7,18]，即促进细胞生存或死亡。PI3K/Akt/mTOR信号通路已经被证实在细胞内对自噬发挥最直接的调控作用[10]，S6是mTOR下游的靶分子，通常通过其磷酸化水平来反映该信号通路的活性。mTOR信号减弱可以导致细胞进一步发生自噬。本研究结果显示，经不同浓度的青蒿琥酯作用后，p-S6蛋白表达减低，这提示青蒿琥酯可能通过下调mTOR信号通路活性促进细胞自噬体形成。

p62在自噬发生早期可调节细胞自噬体的构成，在末期其在细胞内的表达逐渐减少。通常可通过检测p62在细胞内的表达水平来表示自噬发生的程度。在自噬反应发生的初期，LC3参与了自噬反应的主要效应器即自噬溶酶体的构成，LC3(微管相关蛋白1轻链3)的表达水平可表示自噬的发生程度，通过测算LC3BⅡ与LC3BⅠ的比值可表示自噬体的数量和自噬发生的程度。即LC3BⅡ/Ⅰ越高，自噬的程度越高。本研究结果显示，经不同浓度的青蒿琥酯作用后，p62蛋白表达减低，LC3B蛋白表达升高，LC3BⅡ/Ⅰ值增加，提示青蒿琥酯诱导A549细胞发生自噬，而且自噬反应的程度随药物作用浓度、作用时间的增加而逐渐加强。本研究加入细胞自噬抑制剂3-MA后细胞增殖抑制率降低，进一步说明细胞自噬能抑制细胞生存。

综上所述，青蒿琥酯能抑制A549细胞增殖，其机制可能是下调mTOR信号通路的活性，促进细胞发生自噬。

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天津市滨海新区卫计委项目(2012BWKY007)。

黄少祥(E-mail:13820759588@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.25.013

R734.2

A

1002-266X(2017)25-0042-03

2017-04-02)