2-甲氧基雌二醇及其合成中间体的大鼠肺细胞膜色谱行为

张青青，张 苗，尚彩红，周建华，郭丽芳，杜 斌

1)郑州大学第二附属医院药剂科 郑州 450014 2)沈阳药科大学药学院药物制剂教研室 沈阳 110016 3)郑州大学药学院药物分析教研室 郑州 450001

2-甲氧基雌二醇及其合成中间体的大鼠肺细胞膜色谱行为

张青青1)，张 苗2)，尚彩红1)，周建华1)，郭丽芳1)，杜 斌3)#

1)郑州大学第二附属医院药剂科 郑州 450014 2)沈阳药科大学药学院药物制剂教研室 沈阳 110016 3)郑州大学药学院药物分析教研室 郑州 450001

#通信作者，女，1968年8月生，博士，教授，硕士研究生导师，研究方向：抗肿瘤药物的研发，E-mail:dubin@zzu.edu.cn

2-甲氧基雌二醇；细胞膜色谱；靶向性

目的：探讨实验室合成的2-甲氧基雌二醇(2-ME)及其合成中间体的大鼠肺细胞膜色谱行为。方法：经筛选，大鼠细胞膜色谱条件为自制大鼠肺细胞膜色谱柱(10 mm×2 mm)，流动相为10 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，柱温为37 ℃，流速为0.2 mL/min。以沙丁胺醇为阳性对照，以容量因子k′作为指标，考察2-ME及其合成中间体在大鼠肺细胞膜色谱柱上的保留特性。结果：2-ME及合成中间体1、2号化合物在大鼠肺细胞膜色谱柱上均有吸附，且k′依次为2号化合物>1号化合物>2-ME；合成中间体3及4号化合物未表现出吸附特性。2-ME与大鼠肺细胞膜色谱柱的亲和力大于纯硅胶色谱柱、大鼠心肌细胞膜色谱柱和肝细胞膜色谱柱。结论：2-ME在大鼠肺细胞膜上具有特异性亲和。

细胞膜色谱法(cell membrane chromatography，CMC)[1]是将活性组织细胞膜包裹在大孔硅胶表面，利用药物与膜受体间存在的特异性亲和力，在体外动态地模拟药物与靶细胞的相互作用，研究药物与受体的亲和性、可逆性和竞争性的新型亲和色谱技术。该色谱技术在1996年由贺浪冲教授首先提出[2]，经过近年的不断发展，研究人员[3-5]已成功建立了血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、β-胰岛细胞、小鼠巨噬细胞和肿瘤细胞等CMC模型,用以筛选中药活性成分或者研究药物与受体的相互作用。通过对CMC模型的改造，目前已建立起集“活性识别-色谱分离-分析鉴定”于一体的在线二维分析系统[6]。研究人员[6-7]还通过外源重组质粒技术构建了受体高表达CMC模型，改善了传统CMC法中“目标”受体不可控的缺点。

据研究[8]报道，静脉给药时，药物粒径大小直接影响制剂的分布取向。当粒径大于7 μm时，药物可被肺毛细血管截留；而粒径在2～7 μm时，药物可以通过血管床，进入肝、脾或其他组织；粒径在0.05～2.00 μm时，药物可以很快被单核巨噬细胞系统吞噬，可靶向肝脏。已有研究[9]证实，2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol, 2-ME)纳米混悬剂具有明显的肺靶向性，同时2-ME普通溶液的肺靶向性虽不及纳米混悬剂强，但也有一定的肺靶向性，推测其原因可能是2-ME与肺泡表面受体的特异性结合造成的，因此有必要探寻2-ME是否对大鼠肺泡表面受体有亲和性。作者考察了2-ME及其一些合成中间体的CMC行为，以期为更深入的药理活性探寻提供有益指导。

1 仪器、试剂与方法

1.1 主要仪器和试剂 Agilent 1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，AR 1140电子天平(梅特勒-托利多仪器公司)，HMS-350型涡旋振荡器(天津恒奥科技发展有限公司)，Z36HK型冷冻离心机(德国Hermle公司), 电热鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司), RPL-ZD10型装柱机(大连日普利科技仪器有限公司), SHB-Ⅲ型循环水真空泵(郑州长城科工贸有限公司), PHS-3C型pH计(上海雷磁仪器有限公司), KQ-300DE超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。2-ME及其合成中间体1、2、3、4号化合物(自制)，沙丁胺醇(中国药品生物制品检验所)，磷酸氢二钠、氯化钠(分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司)，甲醇(色谱纯，天津四友精细化学品有限公司)，大孔硅胶(5 μm，青岛美高有限公司)。

1.2 溶液的配制 生理盐水：精密称取NaCl 0.9 g，溶解于100 mL超纯水中，置于4 ℃备用。低渗缓冲液：精密称取Tris 0.605 g,KCl 0.370 g,MgSO4·7H2O 0.253 g，溶解于500 mL超纯水中，用HCl调节pH值为7.4后，4 ℃储存备用。10 mmol/L磷酸盐缓冲液：精密称取Na2HPO41.79 g,溶解于500 mL超纯水中，用H3PO4调节pH值为7.4后，4 ℃储存备用。

1.3 CMC模型的建立

1.3.1 大鼠肺、心肌、肝细胞膜的制备 取健康SD大鼠(郑州大学实验动物中心提供)，断颈处死，立即解剖，依次取出心脏、肺和肝脏组织，分别置于4 ℃生理盐水中洗净血污。取1 g肺组织，在少量4 ℃ 生理盐水中剪碎后，转移至玻璃匀浆器中，并加入约10 mL 4 ℃生理盐水,冰浴条件下仔细匀浆至液状。将匀浆液转入50 mL离心管中， 3 000g离心10 min,弃去上清液;向沉淀中加入20 mL生理盐水重新混悬并匀浆，3 000g离心10 min，弃去上清液;重复此操作2 ～ 3次，直至上清液无色。向沉淀中加入10 mL 4 ℃低渗缓冲液，冰浴下超声破膜30 min。将混悬液匀浆后，1 000g离心10 min，取上清液至另一个离心管中,然后12 000g离心20 min，弃去上清液;向沉淀中加入10 mL生理盐水并重新涡旋，再次12 000g离心20 min,沉淀即为肺细胞膜。向肺细胞膜沉淀中加入5 mL生理盐水，得细胞膜悬液，备用。心肌、肝细胞膜混悬液的制备同上。

1.3.2 硅胶预处理 取2.5 g大孔硅胶置于100 mL烧杯中，加入1.0 mol/L 盐酸溶液50 mL混悬，超声混合15 min 后转移至100 mL 三颈瓶中，磁力搅拌下120 ℃回流2 h。将混悬液转移至1 000 mL 烧杯中，加入适量蒸馏水并搅拌，静置，弃去上清液;重复上述操作3～4次，直至上清液pH为7。最后用G4玻璃坩埚抽滤，120 ℃活化7 h,备用。

1.3.3 色谱固定相的制备 取已活化处理过的大孔硅胶50 mg，置于 20 mL具支试管中,在抽真空和涡旋条件下快速注入5 mL 细胞膜混悬液涡旋反应5 min。将混合物转移至10 mL 离心管，4 ℃下磁力搅拌30 min,然后1 000 r/min离心5 min，弃去上清，向沉淀中加入4 ℃生理盐水并重悬，然后500 r/min离心5 min ，弃上清，以除掉未结合的细胞膜，向沉淀中加入10 mmol/L磷酸盐缓冲液5 mL，涡旋混合均匀，4 ℃放置过夜,即得肺细胞膜固定相。

1.3.4 色谱柱的制备 采取湿法装柱。将色谱柱管(10 mm×2 mm)一端扣上筛板，未安装筛板的一端朝上，装入装柱机柱套中。打开装柱机匀浆管上端的螺帽，将放置过夜的固定相混悬液涡旋后注入该匀浆管内，并加入10 mmol/L磷酸盐缓冲液至满，安装匀浆管上端螺帽并拧紧。开启装柱机，以10 mmol/L磷酸盐缓冲液为流动相，调整流速为2 mL/ min，使装柱机压力稳定在10 MPa左右，持续5 min后，关闭电源，打开装柱机匀浆管，取出色谱柱管，立即安装另一端筛板，即得细胞膜色谱柱。

1.3.5 色谱条件的确定 在上述实验条件下，由于固定相表面包裹着肺细胞膜，为了保持肺细胞膜上酶或受体的生物活性，采用pH 7.4的10 mmol/L磷酸盐缓冲液作为流动相，而且选用0.2 mL/min 的低流速和37 ℃的柱温来模拟体内环境。通过紫外扫描，确定2-ME及其合成中间体1、2、3、4号化合物，沙丁胺醇的紫外吸收波长依次为288、285、283、285、287、276 nm。

1.4 2-ME及其合成中间体与大鼠肺细胞膜色谱柱的亲和力测定 用10 mmol/L磷酸盐缓冲液平衡大鼠肺细胞膜色谱柱2 h后，进样(2-ME及其合成中间体1、2、3、4号化合物，沙丁胺醇)10 μL进行检测。根据实验结果计算溶质容量因子k′，用以表示作用强度。k′= (tR-t0)/t0，其中tR为溶质保留时间，t0为不保留的溶剂流出时间，单位均为min。

1.5 2-ME与不同色谱柱亲和力测定 用10 mmol/L磷酸盐缓冲液分别平衡纯硅胶色谱柱、大鼠心肌细胞膜色谱柱和肝细胞膜色谱柱2 h后，进样2-ME 10 μL进行检测，计算k′。

2 结果

2.1 色谱特征 以沙丁胺醇为阳性对照物，以硅胶色谱柱为对照， 2-ME，合成中间体1、2号化合物在肺细胞膜色谱柱有保留，合成中间体3、4号化合物没有保留，见图1。

左：硅胶色谱柱；右：肺细胞膜色谱柱；从上到下依次为：沙丁胺醇，2-ME，1、2、3、4号化合物。图1 试样在不同色谱柱上的保留行为色谱图

2.2 2-ME及其合成中间体与大鼠肺细胞膜色谱柱的亲和力 实验重复3次，平行性良好，实验结果见表 1。根据k′大小，可判断被检测物与大鼠肺细胞膜色谱柱的亲和力大小依次为：沙丁胺醇>2号化合物>2-ME>1号化合物。

表1 被检测物与大鼠肺细胞膜色谱柱的亲和力

2.3 2-ME与不同色谱柱的亲和力 实验重复3次，平行性良好，实验结果见表2，可见2-ME与大鼠肺细胞膜色谱柱的亲和力最大。

表2 被检测物与不同色谱柱的亲和力

3 讨论

已有的对细胞膜色谱的研究主要集中在建立大鼠血管内皮细胞膜色谱模型和心肌细胞膜色谱模型方面[3]。该实验首次建立了大鼠肺细胞膜色谱模型。与心肌和血管相比，肺组织具有较多的结缔组织，故在制备肺细胞膜混悬液过程中，需要加大对肺组织的匀浆强度并延长匀浆时间。在实验操作中，作者比较了T25数显型高速分散机(ULTRA-TURRAX)和玻璃匀浆器的匀浆效果，结果发现T25数显型高速分散机不能完全将肺组织打碎成细胞悬液，在后续装柱过程中，出现堵住筛板的现象；而玻璃匀浆器能充分将肺组织研磨为细胞悬液，并实现成功装柱。装柱过程中，在10 MPa压力下装柱过程持续5 min即可，若持续时间过久，则色谱柱管装填固定相过于厚实，在样品分析过程中整个色谱系统压力过高，甚至出现崩漏现象。由于高温、过酸或过碱的环境均有可能对蛋白质造成破坏，使其失去活性，降低药物与受体的结合[10]，因此，在建立细胞膜色谱模型过程中需要时刻维持4 ℃的环境，以免细胞膜上的酶或受体在实验处理过程中失活。在分析过程中，采用pH 7.4 的磷酸盐缓冲液作为流动相，0.2 mL/min的低流速和37 ℃的柱温来模拟体内环境[11]。

药物若要发挥药效，药物分子必须与受体相互结合,只有能与受体结合的药物分子才可能具有药效。研究[12]表明，活性分子在细胞膜色谱模型上的保留行为与其生物活性密切相关；有保留的分子可能具有生物活性，而没有保留的分子由于不与膜受体结合，难以具有相应的生物活性。利用细胞膜色谱模型筛选活性药物，就是通过色谱保留行为筛选出与细胞膜及膜上受体相结合的化合物。k′和亲和力之间存在一定的正相关性，k′很大程度上反映化合物的内在活性，并与药效作用显著相关[12-13]。药物与受体的结合具有专一性,若两种药物作用于同一受体，则两种药物在色谱柱上的保留时间应该相接近。该实验中，沙丁胺醇在大鼠肺细胞膜色谱柱上的保留时间与2-ME不一致，说明两种药物作用于不同的受体。虽然该实验未能进一步研究2-ME受体的类型，但实验结果可为以后分离研究提供参考。通过比较2-ME及其合成中间体1、2号化合物的k′，合成中间体2号化合物对大鼠肺细胞膜上的受体具有更强的亲和力。而体外药效学研究[13]结果也显示2号化合物确实表现出最大的体外抗癌活性。

总之，该实验揭示了2-ME在大鼠肺细胞膜上的特异性亲和，为2-ME药效学研究提供了一定的实验基础。同时实验结果也表明合成中间体1号和2号化合物对大鼠肺细胞膜上的某些受体具有特异性亲和，可以通过体外药效学实验考察该两种化合物的抗癌活性，并进一步做肺癌药效学实验，将其结果与细胞膜色谱实验结果进行相关性分析。

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(2016-06-28收稿 责任编辑王 曼)

Establishment of rat lung cell membrane chromatography and chromatographic affinity of 2-methoxyestradiol and synthetic derivatives

ZHANGQingqing1),ZHANGMiao2),SHANGCaihong1),ZHOUJianhua1),GUOLifang1),DUBin3)

1)DepartmentofPharmacy,theSecondAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014 2)DepartmentofPharmaceuticalPreparationSchoolofPharmacy,ShenyangPharmaceuticalUniversity,Shenyang110016 3)DepartmentofPharmaceuticalAnalysis,SchoolofPharmacy,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

2-methoxyestradiol;cell membrane chromatography;targeting

Aim: To screen the activity of 2-methoxyestradiol(2-ME) and synthetic derivatives by rat lung cell membrane chromatography.Methods: The lung cell membrane stationary phase(CMSP) was packed into a stainless steel column(10 mm×2 mm), and the HPLC conditions were as follows:a mobile phase consisted of 10 mmol/L phosphate buffer (pH 7.4) at a flow rate of 0.2 mL/min, and the column temperature was 37 ℃. Salbutamol was used as positive control in the screening. The capacity factork′ as chromatographic parameters was used to describe the affinity of 2-ME and its synthetic derivatives. Results: 2-ME,NO.1 synthetic derivative and NO.2 synthetic derivative had chromatographic retention on lung CMSP column andk′ of NO.2 was greater than NO.1 and 2-ME. Thek′ of 2-ME with rat lung CMSP was higher than those with pure silica gel column,rat cardiac muscle CMSP and liver CMSP.Conclusion: 2-ME has the property of specific affinity on the membrane of the rat lung cell membrane.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.02.027

R979.1