申克孢子丝菌酵母相对人急性单核细胞白血病细胞NF－κB信号通路及TNF－α的影响

刘彩霞段志敏杜蕾蕾曾 荣沈永年胡素泉刘维达陈 青李 岷

申克孢子丝菌酵母相对人急性单核细胞白血病细胞NF－κB信号通路及TNF－α的影响

刘彩霞1段志敏1杜蕾蕾1曾 荣1沈永年1胡素泉1刘维达1陈 青2李 岷1

目的:明确申克孢子丝菌酵母相对人急性单核细胞白血病细胞(THP－1)NF－κB信号通路激活和肿瘤坏死因子α(TNF－α)分泌的影响。方法:实时荧光定量PCR分析申克孢子丝菌酵母相刺激THP－1细胞TNF－αmRNA的表达，酶联免疫吸附法检测TNF－α分泌量，免疫印迹法分析申克孢子丝菌酵母相体外作用于THP－1细胞后IκBα和磷酸化IκBα的水平，免疫荧光法观察NF－κB－p65核转位。同时设置地塞米松(NF－κB抑制剂)抑制组，并检测100 nM地塞米松预处理THP－1细胞后TNF－αmRNA水平的变化。结果:申克孢子丝菌酵母相刺激THP－1细胞后6 h TNF－αmRNA水平显著高于空白对照组(P＜0．001)。申克孢子丝菌酵母相刺激THP－1细胞后24 h，TNF－α蛋白水平为(4610．419±121．501)pg/mL，显著高于空白对照组(186．964±98．073)pg/mL，差异具有统计学意义(P＜0．001)。申克孢子丝菌酵母相作用THP－1细胞后30～60 min，磷酸化IκBα蛋白水平显著升高，为时间依赖性。申克孢子丝菌酵母相组细胞核内NF－κB－p65较空白对照组荧光强度增强。100 nM地塞米松预处理各组THP－1细胞后，TNF－αmRNA水平较前明显降低。结论:人THP－1细胞体外与申克孢子丝菌酵母相作用后激活NF－κB信号通路并上调TNF－α分泌。

申克孢子丝菌;单核细胞白血病;肿瘤坏死因子α;NF－κB

孢子丝菌病(sporotrichosis)是一种由双相病原真菌申克孢子丝菌(Sporothrix schenckii)感染引起的亚急性或慢性肉芽肿性疾病。申克孢子丝菌是一种分布于自然界的腐生菌，可从土壤、木材、植物、水果、昆虫、海藻、海生动物及动物粪便中分离出来。孢子丝菌病遍布世界各地，热带及亚热带地区多见，在我国主要集中于东北及长江中下游地区，多为局部微创伤后接触孢子丝菌污染物致病，通常散发，偶因爆发洪水或饲养宠物而引起小范围爆发流行［1－3］。近年孢子丝菌病发病率较前攀升，随着抗真菌药物的应用，多药耐药菌株不断出现，威胁人类健康［4］。因此，研究人体天然免疫反应在抗申克孢子丝菌感染过程中的作用极为重要。单核巨噬细胞作为宿主天然免疫中重要的反应细胞，能够识别并吞噬、杀伤、清除入侵的申克孢子丝菌病原体［5］。本研究旨在探讨申克孢子丝菌酵母相能否激活人急性单核细胞白血病细胞(Human acute monocytic leukemia cell line，THP－1)的核转录因子kappaB(NF－κB)信号通路并诱导分泌TNF－α。

1 材料和方法

1．1 材料细胞、菌株、主要试剂:申克孢子丝菌标准株CMCC(F)D1a，由中国微生物菌种保藏管理委员会医学真菌中心提供。人THP－1细胞株购自美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection，ATCC)。兔抗人IκBα、磷酸化IκBα抗体和β肌动蛋白抗体为美国Cell Signaling Technology公司产品。TNF－α酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒为欣博盛公司产品。PrimeScript RT Master Mix逆转录酶试剂盒为日本TaKaRa公司产品。iTaq Universal SYBR Green Supermix为美国Bio－rad公司产品。佛波酯(PMA)、Curdlan为美国Sigma公司产品，地塞米松为美国Invivogen公司产品。

1．2 方法(1)申克孢子丝菌酵母相诱导:将申克孢子丝菌接种至沙堡弱固体培养基25℃培养7 d，活化3次后转种于含2%葡萄糖的脑心浸液琼脂培养基，37℃5%CO2下培养，每14天传代，观察菌落及革兰染色后显微镜下形态是否完全转化为酵母相。培养14～28天制备酵母相菌液，生理盐水冲洗2遍，计数后配制成109CFU/mL浓度菌悬液待用。(2)细胞培养:人THP－1细胞用含10%胎牛血清、1%青链霉素的RPMI 1640培养基，于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养、传代。将细胞制备成2×105/mL细胞悬液，接种于12孔细胞培养板(每孔1 mL)及6孔细胞培养板(每孔2 mL)，加入100 ng/mL PMA刺激48 h后诱导形成巨噬细胞，根据预实验，分别加入终浓度为2×106CFU/mL的申克孢子丝菌酵母相及100μg/mL的Curdlan共培养。(3)实时荧光定量逆转录PCR:申克孢子丝菌与THP－1细胞共孵育，并设阳性刺激物Curdlan组、空白对照组、地塞米松抑制组(100 nM NF－κB抑制剂地塞米松预先30 min与THP－1细胞共培养)。预实验中曾设置多个申克孢子丝菌与THP－1细胞共孵育时间点，刺激后随时间延长，TNF－α mRNA表达水平渐升高，6 h后达最高峰，继续延长作用时间则开始降低。本实验选择3、6 h作为观察时间，而地塞米松抑制组选择6 h。TRIzol法抽提总RNA，按PrimeScript RT Master Mix逆转录酶试剂盒说明书将1μg总RNA反转录为cDNA。使用ABI 7300 PCR仪，采用Syber green法对目的基因进行扩增。以β－肌动蛋白作为内参照，引物TNF－α及β－肌动蛋白由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列TNF－α上游5'－CGAGTGACAAGCCTGTAGC－3'，下游5'－GGTGTGGGTGAGGAGCACAT－3'，β－肌动蛋白上游5'－TCTGGCACCACACCTTCAT－3'，下游5'－AGGCATACAGGGACAGCAC－3'，反应条件:预变性95℃10 min，变性95℃15 s，退火60℃30 s，延伸72℃30 s，循环数40。采用2－△△Ct法计算目的基因的变化水平，△Ct=目的基因－内参照(β肌动蛋白);某一样品的△△Ct=某一样品△Ct–对照组样品的△Ct。2－△△Ct值即为实验组目的基因较对照组目的基因表达的倍数。(4)ELISA法:刺激THP－1细胞后24 h，收集上清液，按照试剂盒说明书检测TNF－α含量。根据预实验，申克孢子丝菌酵母相刺激THP－1细胞后，上清液TNF－α含量升高更明显。设置不同的共孵育时间，发现刺激24 h后上清液TNF－α含量达到最高。本实验选择24 h作为观察时间。(5)Western印迹分析:收集处理后的THP－1细胞，裂解细胞，提取总蛋白。应用BCA定量法计算蛋白浓度，煮沸变性，SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，湿转至PVDF膜上。5%血清白蛋白(BSA)封闭2 h，兔抗人单克隆抗体4℃孵育过夜。TBST液(Tris－Buffered Saline Tween－20)洗膜3次后，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG第二抗体孵育2 h，Supersignal试剂显色发光，检测申克孢子丝菌酵母相与THP－1细胞共孵育30、60 min后IκBα和磷酸化IκBα水平变化。(7)免疫荧光法观察NF－κB－p65核转位:THP－1细胞以5×104/孔的密度接种于培养皿内，细胞培养同上。共孵育16 h后吸弃培养基，细胞待PBS清洗后用4%多聚甲醛室温固定30 min，并用0．1% Triton X－100室温通透15 min。3%BSA室温封闭1 h后，细胞与NF－κB－p65抗体4℃孵育过夜，TBST洗后与Texas Red－羊抗兔IgG室温避光孵育1 h，TBST漂洗干净后用500 ng/mL DAPI染核，避光孵育10 min，荧光显微镜下观察，NF－κB－p65呈红色荧光，细胞核为蓝色，核转位时红色荧光进入细胞核。

1．3 统计学方法应用SPSS 19．0统计软件，计量数据以珋x±s表示。不同时间不同组别间TNF－αmRNA比较采用多因素方差分析;不同组别间TNF－α蛋白含量的比较采用单因素方差分析，并采用LSD－t检验。P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 申克孢子丝菌酵母相对THP－1细胞TNF－α mRNA水平的影响申克孢子丝菌酵母相刺激THP－1细胞后3、6 h，TNF－αmRNA水平逐渐增高，均显著高于空白对照组，各组间差异有统计学意义(F= 4503．89，P＜0．001)。TNF－αmRNA水平的变化情况，见表1。

2．2 申克孢子丝菌酵母相对THP－1细胞TNF－α表达的影响申克孢子丝菌酵母相与THP－1细胞共孵育24 h，申克孢子丝菌组、Curdlan组、空白对照组的上清液中TNF－α蛋白浓度分别为(4610．419± 121．501)pg/L、(4505．824±198．124)pg/L、(186．964± 98．073)pg/L，申克孢子丝菌组、Curdlan组与空白对照组比较TNF－α蛋白浓度均升高，差异有统计学意义(F=1802．37，P＜0．001)。

表1 申克孢子丝菌酵母对TNF－αmRNA水平的影响

表1 申克孢子丝菌酵母对TNF－αmRNA水平的影响

注:a与空白对照组比较，P＜0．01

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2．3 申克孢子丝菌酵母相对THP－1细胞IκBα激活的影响刺激后30 min，与空白对照组比，申克孢子丝菌酵母相刺激后30 min磷酸化IκBα蛋白水平已升高，60 min时磷酸化IκBα蛋白水平显著升高;IκBα蛋白水平则相应有所降低，如图1示申克孢子丝菌酵母相能够激活THP－1细胞信号分子IκBα，并呈时间依赖性。

图1 申克孢子丝菌酵母对THP－1细胞IκBα活化的影响

2．4 申克孢子丝菌酵母相对THP－1细胞NF－κB－p65核转位的影响结果见图2，空白对照组的NF－κB－p65主要位于细胞浆，细胞核内仅少量分布;而申克孢子丝菌酵母相刺激THP－1细胞后，细胞核内NF－κB－p65荧光强度增强，进一步提示申克孢子丝菌酵母相能够激活NF－κB通路。

图2 申克孢子丝菌酵母对THP－1细胞NF－κB－p65核转位的影响

2．5 地塞米松对申克孢子丝菌酵母相上调THP－1细胞TNF－αmRNA的影响100 nM地塞米松预处理THP－1细胞30 min后，分别与申克孢子丝菌酵母相、Curdlan共培养6 h，TNF－αmRNA水平见表2。用地塞米松阻断后各组TNF－αmRNA水平较未用地塞米松组明显降低，差异具有统计学意义(F=564．81，P＜0．001)，表明100 nM地塞米松抑制申克孢子丝菌酵母相诱导的TNF－αmRNA上调。

表2 地塞米松对申克孢子丝菌酵母上调THP－1细胞TNF－αmRNA转录的影响

表2 地塞米松对申克孢子丝菌酵母上调THP－1细胞TNF－αmRNA转录的影响

注:a与空白对照组比较，P＜0．001;b与未用地塞米松阻断组比较，P＜0．01

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3 讨论

天然免疫在抗真菌感染中发挥重要作用，单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等作为主要的天然免疫细胞，识别、吞噬入侵的真菌，启动细胞内信号传导通路，诱导特异性基因表达，最终合成分泌多种细胞因子，构成抵御病原微生物入侵的第一道防线［6，7］。THP－1细胞是一种人急性单核细胞白血病细胞，经PMA诱导可分化为成熟的巨噬细胞，常用于单核－巨噬细胞的功能研究［8］。申克孢子丝菌是一种双相致病真菌，该菌宿主体内和37℃培养为酵母相，室温下为分生孢子或菌丝相，皮肤创伤感染菌丝相待其转换为酵母相后致病，本病患者的组织病理和电镜检查证实申克孢子丝菌在宿主体内仅为酵母相［9］。因此，本研究选用申克孢子丝菌酵母相为研究对象，探讨THP－1细胞经申克孢子丝菌酵母相刺激后能否激活NF－κB信号通路并诱导分泌TNF－α。TNF－α是具有广泛生物学效应的前炎症因子，主要由激活的单核巨噬细胞或淋巴细胞分泌，能促进IL－12、IFN－γ表达，增强巨噬细胞吞噬功能，促进中性粒细胞和单核细胞趋化及树突状细胞迁移，诱发炎症反应［10］。有研究指出，TNF－α在抗白念珠菌感染中发挥重要作用［11］。Carlos等［12］对申克孢子丝菌感染的小鼠模型研究发现，TNF－α表达降低时小鼠感染的病情加重。我们研究中发现，申克孢子丝菌酵母相刺激THP－1细胞后，TNF－αmRNA表达呈现时间依赖效应，刺激后3 h已经出现升高，6 h时为3 h的4．63倍。Curdlan是一种β－1，3－D－葡聚糖，被单核巨噬细胞表面C－型凝集素受体－1(Dectin－1)识别后，能激活细胞内信号通路，合成分泌多种细胞因子［13］。我们选用Curdlan做为激活THP－1细胞的阳性对照物，本实验诱导出与申克孢子丝菌酵母相相似的效应，刺激后6 h TNF－α mRNA水平比3 h时升高3．95倍。申克孢子丝菌酵母相作用THP－1细胞后24 h，上清液TNF－α蛋白含量显著高于空白对照组。此研究表明申克孢子丝菌酵母相在转录及翻译水平均能诱导THP－1细胞TNF－α表达上调。Negrini等［14］和Sass 等［15］用申克孢子丝菌酵母相或脂类抗原刺激小鼠腹腔巨噬细胞，能诱发炎症反应使TNF－α等表达增加。Romo－Lozano等［16］用申克孢子丝菌酵母相刺激肥大细胞，激活ERK信号通路，诱导分泌IL－6、TNF－α，引发固有免疫反应。Verdan等［17］用申克孢子丝菌酵母相刺激树突状细胞也能诱导TNF－α分泌增强。以上研究与本研究结果一致，可见TNF－α在抗申克孢子丝菌感染中发挥重要作用。

细胞内信号分子NF－κB在调控前炎症因子转录过程中起重要作用，在无外界刺激因素时，p50和p65组成的亚单位与IκBα结合成复合体，在细胞浆中处于失活状态;适宜刺激后，IκB激酶复合体的激活可使IκBαN端保守的丝氨酸残基磷酸化、降解，导致NF－κB p50、p65二聚体与IκBα解离，随后移位入核，结合到NF－κB特异性结合位点，进而调控相应的基因转录［18］。申克孢子丝菌酵母相刺激THP－1细胞后能使磷酸化IκBα水平升高，促进NF－κB－p65移位入核，最终激活NF－κB信号通路。

有研究证实，100 nM地塞米松能够阻断NF－κB信号通路并抑制多种细胞因子的表达［19］。100 nM地塞米松预处理THP－1细胞抑制了申克孢子丝菌酵母诱导的TNF－αmRNA上调，以上研究提示申克孢子丝菌酵母相可能通过激活NF－κB信号通路调控TNF－α的合成。但选用地塞米松作为NF－κB信号通路阻断剂，不能排除对实验的其他影响，为本研究的不足之处。

本研究发现，人THP－1细胞经申克孢子丝菌酵母相刺激后激活NF－κB信号通路并诱导分泌TNF－α，参与机体抗申克孢子丝菌天然免疫反应。Toll样受体2(TLR2)、TLR 4和Dectin－1是识别真菌的主要模式识别受体，已有研究表明TLR2和TLR4在抗申克孢子丝菌感染的天然免疫中发挥重要作用［7，14，15，20－22］，我们将进一步研究Dectin－1及其下游信号通路在抗申克孢子丝菌感染免疫中的作用。

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(收稿:2016－09－13修回:2016－11－17)

Effects of Sporothrix schenckii yeasts on the activation of NF－κB signal pathway and secretion of TNF－αin human acute monocytic leukemia cells

LIUCaixia1，DUANZhimin1，DULeilei1，ZENGRong1，SHENYongnian1，HUSuquan1，LIUWeida1，CHENQing2，LIMin1．
1．InstituteofDermatology，ChineseAcademyofMedicalSicencesandPekingUnionMedicalCollege，Jiangsu KeyLaboratoryofMolecularBiologyforSkinDiseases，Nanjing210042，China;2．JiangsuProvinceBlood Center，Nanjing210042，China
Correspondingauthors:LIMin，E－mail:drlimin@sina．cn
CHENQing，E－mail:qngchen@hotmail．com

Objective:To determine the effects of Sporothrix schenckii yeasts on the activation of NF－κB signal pathway and secretion of TNF－αin human acute monocytic leukemia cells(THP－1)．Methods:The expression of TNF－αmRNA was detected by Real－time fluorescence quantitative PCR and enzyme－linked immunosorbent assay respectively．The level of phosphorylated IκBαwas detected by Western blot．NF－κB－p65 nuclear translocation was measured by immunofluorescence．The level of TNF－αmRNA in THP－1 pretreated with 100 nM Dexamethasone(a NF－κB inhibitor)for 30 minutes was detected by Real－time fluorescence quantitative PCR．Results:The levels of TNF－αmRNA in THP－1 cells treated with Sporothrix schenckii yeasts for 6 hours were increased compared with the blank control group(P＜0．001)．The secretion level of TNF－αin the Sporothrix schenckii yeasts group was 4610．419±121．501 pg/mL，which was higher than that inthe blank group(186．964±98．073 pg/mL)，with a significant difference(P＜0．001)．Phosphorylation IκBα protein increased obviously and in a time－dependent manner after treated with Sporothrix schenckii yeasts from 30 minutes to 60 minutes．The fluorescent intensity of NF－κB－p65 in the Sporothrix schenckii yeasts group was stronger than that in the blank group．The level of TNF－αmRNA was decreased in the THP－1 macrophages treated with 100 nM dexamethasone in the three groups．Conclusion:Sporothrix schenckii yeasts can increase the expression of TNF－αthrough enhancing the activation of NF－κB pathway．

sporothrix schenckii;monocytic leukemia;TNF－α;NF－κB

国家自然科学基金(编号:81502739)江苏省自然科学基金(编号:BK20150068)

1中国医学科学院北京协和医学院皮肤病研究所，江苏省皮肤性病分子生物学重点实验室，南京，210042 2江苏省血液中心，南京，210042

李岷，E－mail:drlimin@sina．cn陈青，E－mail:qngchen@hotmail．com