整合素β8在恶性黑素瘤细胞增殖及侵袭中的作用

整合素β8在恶性黑素瘤细胞增殖及侵袭中的作用

廖晓容1 高永良2

目的:明确整合素β8(ITGB8)在恶性黑素瘤侵袭转移中的作用。方法:Transwell侵袭实验在黑素瘤细胞系A375中获得侵袭性癌细胞和相对静止性癌细胞，RT－PCR比较两者整合素家族的表达。流式分选ITGB8细胞，比较其侵袭能力的差异。使用siRNA敲除技术敲低ITGB8，敲低效率分别为:si1组50%，si2组70%，si3组80%，比较其增殖、侵袭能力的变化。Western bolt检测细胞周期蛋白、基质金属蛋白酶及EMT相关分子的表达变化，提取细胞核蛋白比较细胞核内β－catenin的变化。利用TCF4的启动子报告质粒检测Wnt/β－catenin信号通路的激活情况。结果:ITGB8在侵袭性癌细胞中高表达，是静止性癌细胞的5倍(P＜0．01);ITGB8阳性组侵袭细胞数为516±45，阴性组为120±22，差异有显著性(P＜0．01);与Mock组细胞相比，si2和si3组细胞的增殖速度明显减弱(P＜0．01)，敲低后细胞阻滞在S期。与Mock细胞相比Cyclin D1、MMP2、MMP9、MMP7、Ncadherin、Vimentin在si2和si3细胞中的表达明显减少，Ecadherin明显增加。si2、si3细胞核内β－catenin相比Mock组明显减少(P＜0．05)。敲低ITBG8后TCF4的启动子活性明显降低。结论:ITGB8对恶性黑素瘤的增殖及侵袭转移具有重要作用，可能是通过调控Wnt/β－catenin信号通路发挥作用。

恶性黑素瘤;TGB8;Wnt/β－catenin信号通路;侵袭;转移

恶性黑素瘤是危害人类健康的恶性肿瘤，是女性三大恶性肿瘤之一，具有恶性程度高、转移早、死亡率高的特点。侵袭、转移是恶性黑素瘤的主要特点和致死原因［1］。近年来恶性黑素瘤治疗手段不断改进，但其死亡率依然较高，主要原因就是对其侵袭、转移的机制认识不清楚。最近研究发现，整合素家族在肿瘤的发生、侵袭、转移中越来越被关注，并发现整合素β8(integrinβ8，ITGB8)在前列腺癌的发生［2］、肝癌的耐药［3］、胃癌的淋巴结转移［4］、乳腺癌的肺转移［5］等都发挥作用，并且发现ITGB8同ITGB6具有活化TGF－β的作用［6］。但ITGB8在黑素瘤中的作用及其分子机制并不清楚。为此，我们研究了ITGB8在恶性黑素瘤细胞增殖及转移中的作用，探讨ITGB8对黑素瘤细胞生物学行为的影响及可能的机制。

1 材料和方法

1．1 细胞培养、试剂和仪器A375细胞系(ATCC提供)，DMEM培养基(美国Gibco公司)，胎牛血清(以色列Biological Industries公司)，100 U/mL青霉素和100 g/L链霉素(美国Gibco公司)，胰酶、EDTA(北京索莱宝);ITGB8鼠抗人单克隆抗体(Abcam，ab30436)，RIPA裂解液、SDS－PAGE蛋白上样缓冲液(5×)、SDS－PAGE凝胶配制试剂盒、蛋白标准品、细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒、CCK8检测试剂(碧云天)，硝酸纤维素(NC)膜、化学发光试剂盒(Immun－StarTM WesternCTM Chemiluminescence kit)(美国Biorad公司)。

1．2 siRNA构建及转染A375细胞siRNA交由吉玛基因公司合成。siITGB8序列分别为:Mock:ACCCGTTTATGTGTCTCCCGGCAAA，sh1:CATGAAACTTTCAGGTGCAACTTCTsh2:ACCGCTGCATTTGTCTGCCTGCAAAsh3:TGAAGACAATAGATGTGCATCTTCA。

利用LipofectamineTM2000(Thermofisher公司)的转染试剂进行转染，将A375细胞消化重悬后取2× 105个铺于6孔板中，待细胞贴壁后采用无血清的培养基饥饿6 h，配制转染试剂200μL=10μL LipofectamineTM2000+10μL siRNA+180μL OPTI－MEM。摇晃着加入6孔板中，6 h后换成正常的含血清培养基，48 h后取细胞进行检测及后续实验。

1．3 RT－PCR引物由Invitrogen公司合成，稀释引物前瞬时离心，按照说明书，使用灭菌水将引物稀释成10 nM的工作液，总RNA提取采用RNAiso。cDNA逆转录和PCR采用TakaRa公司的逆转录试剂盒及定量PCR试剂盒。

1．4 Western blot取10 cm培养皿细胞1皿用PBS溶液润洗2次，置于冰上，加入RIPA蛋白裂解液400 μL，用细胞刮反复搔刮细胞，在冰上放置30 min。收集蛋白裂解液至1．5 mL EP管中，15000 r/min 4℃离心15 min。吸取转移上清蛋白液至新的1．5 mL离心管中。蛋白浓度测定采用Thermo公司BCA蛋白浓度检测试剂盒测定，制作标准曲线后，计算蛋白浓度，并将各样品浓度调为一致。按照比例添加5X SDSPAGE蛋白上样缓冲液，混匀后100℃煮5 min充分变性蛋白。照上述方法配制好分离胶和浓缩胶，将玻璃板组装入电泳槽中，加入500 mL电泳液，然后拔出梳子，使用微量加样器上样，每孔上样30μg总蛋白，样品旁孔加入预染的蛋白marker。电泳至溴酚蓝到达胶的底端处时停止电泳，将滤纸和PVDF膜浸泡入配好的膜转移缓冲液中，将滤纸、PVDF膜及凝胶制作三明治，放入电转槽中。使用湿转，设定转膜电流为恒流150 mA，转膜时间为90 min。把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。转膜完毕后，将膜放入准备好的封闭液中(5%脱脂奶粉溶液)，在摇床上缓慢摇动，室温封闭1～2 h。取出封闭后的PVDF膜，立即加入稀释好的一抗，4℃孵育过夜。取出孵育一抗的膜，使用PBST洗涤3次，每次15 min，然后将膜放入稀释好的二抗溶液中，室温摇床上缓慢摇动孵育2 h，然后使用PBST洗涤3次，每次15 min。蛋白检测:使用Thermo公司的显影液进行蛋白显影，并照相。

1．5 Transwell侵袭实验使用无血清的RPMI 1640培养基(预冷至4℃)，等比例稀释基质胶，吸取10μL稀释好的基质胶，均匀涂布于Transwell小室上室底部的膜表面，37℃培养箱30 min使基质胶凝固。分别消化Mock、sh1、sh2组细胞并洗涤去除血清后使用无血清RPMI 1640培养基重悬细胞，吸取2×105细胞200μL加入Transwell小室的上室，下室加入500μL 10%FBS的RPMI 1640培养基。培养24 h后，取出培养板，用PBS润洗小室2次然后用4%多聚甲醛溶液室温固定15 min。A染液染色，然后用棉签轻轻擦去膜上面的细胞，洗净后随机选取5个视野照相并计数细胞，进行统计分析。

1．6 CCK8及细胞周期测定按照碧云天公司提供的说明书进行。

1．7 统计学方法使用SPSS 17．0软件对相关数据进行统计学分析。

2 结果

2．1 Transwell模型分选侵袭差异的两类细胞如图1a中模式图所示，我们利用在A375中获得侵袭能力具有差异的两区细胞，利用擦刮和胰酶消化的方法可以得到上下两群细胞(上群为静止性癌细胞;下群为侵袭性癌细胞)。利用RT－PCR的方法比较常见的整合素家族分子在上下两群细胞间的差异(图1b)，发现整合素β8(ITGB8)表达差异最为显著(5倍)。在A375中检测发现正常的A375中12%的细胞是ITGB8阳性细胞，并检测了分析出来的阴性核阳性细胞ITBG8的表达差异，发现差异具有显著性，进一步说明分选的效率达到实验的要求(图1c)。在分选得到了阴性核及阳性两群细胞后，分别进行Transwell侵袭实验，发现ITBG8阳性细胞具有更强的侵袭能力，ITGB8阴性组为(120±22)个，阳性组为(516±45)个，差异有显著性(图1d，P＜0．01)，反过来也验证了ITBG8可以作为侵袭性恶性黑素瘤细胞的标志物。

图1 1a:用胰酶消化的方法得到静止性癌细胞和侵袭性癌细胞，1b:用RT－PCR的方法发现ITBG8表达有显著差异性，1c:用流式分选再次证明ITBG8表达有显著差异性，1d:用Transwell侵袭实验，证实ITBG8阳性细胞与阴性细胞侵袭力差异有显著性

2．2 siRNA下调ITBG8的表达对黑素瘤细胞生物学行为的影响为证明ITGB8对A375细胞侵袭能力的影响，我们利用siRNA技术选择性的敲低ITBG8的表达，如图2a所示，通过RT－PCR和Western Blot发现在合成的3个siRNA中，si2和si3的调低可以达到70%以上。利用CCK8实验，发现下调ITBG8可明显抑制细胞的增殖能力(图2b)，细胞周期检测发现，下调ITBG8可明显增加S期，而减少G0/G1期(图2c)。利用下调ITBG8细胞及对照细胞进行Transwell侵袭实验，同样发现下调ITGB8后可抑制细胞的侵袭能力，侵袭的细胞数Mock组为(573±57)个，si2组为(210±29)个，si3组为(125±20)个，差异均具有统计学意义(P＜0．01)(图2d)。

2．3 下调ITBG8后对细胞周期及侵袭转移相关蛋白的表达Cyclin D1的影响在下调ITBG8的细胞中发现Cyclin D1的表达明显降低。通过Western Blot发现在下调ITBG8细胞中后si2、MMP9、MMP7、Ncadherin、Vimentin在和si3中明显降低，Ecadherin在si2和si3中明显增加(如图3)。我们利用细胞核提取试剂盒在Mock和si2、si3细胞中得到了细胞核蛋白，通过检测β－catenin的表达量发现敲低ITGB8后可以明显减少核内β－catenin的量(图3a)。进一步我们利用了TCF4的启动子双荧光素报告系统，通过转染TOP、FOP和海参荧光素质粒，24小时后检测其荧光素值，发现敲低ITBG8后可以明显降低TCF4的启动子活性，抑制了Wnt/β－catenin信号通路的活化(图3b)。

图2 2a:用RT－PCR和Western Blot发现si2和si3表达下调，RT－PCR的方法发现ITBG8表达有显著差异性，2b:敲低ITBG8，显著抑制细胞的增殖能力，2c:用细胞周期试剂盒发现敲低ITBG8，可以明显增加S期，而减少G0/G1期，2d:敲低细胞和Transwell侵袭实验同样证实ITGB8降低，可抑制细胞的侵袭能力，差异有显著性图3 3a:通过检测β－catenin的表达量，发现敲低ITGB8可明显减少核内β－catenin的量;3b:用TCF4的启动子双荧光素报告系统，通过转染TOP、FOP和海参荧光素质粒，同样证实敲低ITBG8后可明显减弱TCF4的启动子活性

3 讨论

整合素是细胞表面受体与细胞外基质相互作用的重要分子，由α和β两种亚基结合而成，目前发现整合素家族包括了18个α亚基和8个β亚基共同组成24个整合素分子，其配体包括了细胞外基质的主要成分如胶原、层黏连蛋白、纤维连接蛋白及骨桥蛋白等。通过调节细胞外基质而影响细胞形状、细胞迁移能力以及细胞周期变化。整合蛋白自身并不具有激酶结构域或酶活性，其发挥作用主要依靠其他信号分子的作用来传输信号［7，8］。目前研究发现整合素家族分子在肿瘤的发生、发展、耐药治疗等都有重要作用［9－11］。有研究发现如果在干细胞表达中缺失整合素会导致细胞分化异常而导致肿瘤的产生［12］。吴殿青的研究发现整合素信号能够调控中性粒细胞的极性，猜测其在肿瘤免疫中可能也发挥作用［3］。Cordes等［13］确定β1－整合素(β1－integrin)/FAK/皮层肌动蛋白(cortactin)信号传导途径在头颈部鳞状细胞癌抗放射治疗中发挥着关键性作用。Moore的研究发现通过αvβ6靶向抗体264RAD可以明显减少乳腺癌的大小和侵袭，联合赫赛汀治疗则能完全根除小鼠肿瘤［14］。抗整合素ct5131的抗体能抑制神经胶质瘤细胞与ECM的黏附，从而抑制肿瘤细胞生长［15］。

恶性黑素瘤是一种恶性程度极高的肿瘤，目前全球的死亡率为4/5，其恶性程度与其高侵袭高转移的特性密切相关，临床上较难早期诊断，发现时病情已经迅速发展。因此能够阐述其侵袭转移的机制对其预后的判断，治疗手段的发展都具有重要意义［16－18］。在肿瘤细胞的侵袭转移过程中，基质金属蛋白酶和上皮间质转化(EMT)被认为是其重要的机制和指标分子，肿瘤细胞通过增加基质金属蛋白酶的表达，不断破坏周围的组织结构，同时获得侵袭的空间。EMT是近年来逐渐被认可的肿瘤侵袭转移新机制，EMT最初是在胚胎发育的过程中被发现，随后Wenberge教授将其引入肿瘤的侵袭转移中，即上皮源性的肿瘤细胞在发生发展中可以通过发生EMT而获得间叶源性细胞的表型，具有更低的黏附能力，和更强的运动能力，而Ecadherin、Ncadherin、Vimentin被认为是细胞发生EMT重要的指标分子，ITBG8一方面可以通过分泌更多的基质金属蛋白酶来获得侵袭空间，另一方面也可以通过EMT来获得更强运动能力。为了进一步探讨ITBG8是通过什么样的机制来调控细胞周期及侵袭转移相关蛋白的表达，我们查阅文献发现与周期及侵袭相关的信号通路是Wnt/β－catenin信号通路，经典的Wnt/β－catenin信号通路是细胞在Wnt蛋白的作用下通过分子间的相互作用引起β－catenin在细胞浆的累积而进入细胞核结合TCF的启动子区进而引起下游分子的变化，例如Cyclin D1、MMP2、MMP9、MMP7等都是其经典的下游分子。而β－catenin在细胞内还会与Ecadherin相互结合在细胞膜上，Ecadherin的表达降低意味着会有更多的β－catenin得到释放，而细胞核激活Wnt/β－catenin信号通路。

在本实验中，我们通过Transwell实验成功的分离了恶性黑素瘤细胞的两个亚群，并在此基础上研究了整合素家族在其中的表达差异，发现ITGB8在两个亚群中的表达明显不同，通过Transwell侵袭实验，我们发现ITBG8阳性细胞具有更强的侵袭能力，ITGB8阴性组为(120±22)个，阳性组为(516±45)个，差异有显著性，说明ITBG8可能在恶性黑素瘤侵袭转移中具有重要作用，反过来也验证了ITBG8可以作为侵袭性恶性黑素瘤细胞的标志物。我们还证实了ITBG8可以影响恶性黑素瘤细胞的细胞周期，利用CCK8实验，我们发现下调ITBG8可明显抑制细胞的增殖能力，同时明显增加S期，并减少G0/G1期，利用下调ITBG8细胞及对照细胞进行Transwell侵袭实验，同样发现下调ITGB8后可抑制细胞的侵袭能力。实验中我们发现敲低ITBG8后可以明显降低TCF4的启动子活性，抑制了Wnt/β－catenin信号通路的活化。我们推测其具体的分子调控机制可能和Wnt/β－catenin信号通路的调控有关［19］，利用Wnt/β－catenin信号通路激活判断标准，我们进一步证明了ITBG8确实是可以通过调控Wnt/β－catenin信号通路进一步调控肿瘤细胞的周期及侵袭转移能力。

通过本实验我们认为ITGB8对恶性黑素瘤的增殖及侵袭转移具有重要作用，可能是通过调控Wnt/β－catenin信号通路发挥作用。然而由于实验条件的限制，我们的研究仍然不足，如果有能力进行更大范围的基因及信号通路的筛选，可能会寻找到更有意义的分子，且在ITBG8的作用这方面没有进行体内实验，缺少了一个重要证据。但是我们的研究结果仍然给研究人员提供了重要的方向和思路，提示ITBG8在恶性黑素瘤的发生发展中可能起到了关键作用。

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(收稿:2016－02－15修回:2016－06－23)

The role of integrinβ8 in the invasion and metastasis of malignant melanoma

LIAOXiaorong1，GAOYongliang2．
1．DepartmentofDermatology，theSixthPeople＇sHospitalofChongqing，Chongqing400060，China;2．DepartmentofDermatology，theFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity，Chongqing400016，China
Correspondingauthor:GAOYongliang，E－mail:gao2418@126．com

Objective:To determine the role of integrinβ8(ITGB8)in the invasion and proliferation of malignant melanoma．Methods:Melanoma cell line A375 cancer cells were divided into invasive cancer cells and non－invasive cancer cells through Transwell invasion experiment．The expression of integrin family in the A375 cancer cells was detected by RT－PCR．The invasive abilities of the A375 cancer cells of ITGB8 negative and positive cells were compared by flow cytometer．The ITGB8 positive A375 cancer cells were knocked out by siRNA knockout technology and the removal efficiency was 50%in si1 group，70%in si2 group and 80% in si3 group．The proliferation and invasion were compared among the three groups．The cellcycle protein molecules，matrix metalloproteinases and EMT related molecule were detected by Western bolt．The nucleus protein was extracted to compare the changes of Wnt/beta－catenin in the nucleus of the A375 cancer cells in different knockout efficiency．The activation of beta－catenin signaling pathway was detected through TCF4 promoter report plasmid(TOP/FOP)test．Results:The expression level of ITGB8 in invasive cancer cells was 5 times as high as in non－invasiveβ8(P＜0．01)．The number of ITGB8 positive invasive cancer cells was 516 ±45，which was higher than that in ITGB8 negative invasive cancer cells(120±22)，with a significant difference(P＜0．01)．The proliferation rate of the cells in si2 group and si3 group was lower than that in MOCK cells．Compared with the cells in MOCK group，the expression of Cyclin D1，MMP2，MMP9，MMP7 and Ncadherin，Vimentin decreased and Ecadherin increased in si2 and si3 groups．The amount of the beta－catenin in cell nucleus in the cells of si2 and si3 group was lower than that in Mock group．Promoter activity of TCF4 decreased after ITBG8 removed．Conclusion:ITGB8 plays an important role in the process of invasionand proliferation of malignant melanoma，which may through regulating the Wnt/beta－catenin signaling pathways．

Malignant melanoma，ITGB8，Wnt/beta－catenin signaling pathway，infect，transfer

1重庆市第六人民医院皮肤科，重庆，400060 2重庆医科大学附属第一医院皮肤科，400016

高永良，E－mail:gao2418@126．com