II型先天性厚甲症一家系KRT基因突变检测

曹 静孙乐乐付希安王真真于功奇刘 红张福仁，

·论著·

II型先天性厚甲症一家系KRT基因突变检测

曹 静1孙乐乐2付希安2王真真2于功奇2刘 红2张福仁1，2

目的:检测先天性厚甲症一家系中KRT6b和KRT17基因突变位点。方法:提取先证者、其父母(母亲为患者，父亲正常人)及100名正常对照者外周静脉血DNA，PCR技术扩增KRT6b和KRT17基因编码序列，Sanger测序法对PCR扩增产物进行测序。结果:先症者及其母亲在KRT17基因1号外显子上存在错义突变(c．275A＞G)，KRT6b基因不存在任何突变。先证者父亲及100名正常对照者中未检测到任何突变。结论:此家系患者是由于KRT17基因突变(c．275A＞G，p．Asn92Ser)所致。

先天性厚甲症;基因突变;KRT基因

先天性厚甲症(pachyonychia congenital，PC)是一种罕见的常染色体显性遗传性皮肤病，1906年由Jadasshon和Lewandowsky首先报道。本病以厚甲、掌跖角化、多汗，毛囊角化为特征。根据临床表现分为4型:PC－I型又称Jadasshon－Lewandowsky综合征(OMIM167200)，最为常见，除上述特征性表现外多有口腔黏膜白斑;PC－II型又称Jackson－Lawell综合征(OMIM167210))，多有胎生牙及多发性囊肿;PC－III型较罕见，有眼部受累;PC－IV型有咽喉损害、智力障碍及色素沉着等临床表现。前期通过DNA测序技术发现PC的发生与角蛋白(KRT)相关［1］，其中PC－I型为KRT6a和KRT16基因突变所致，PC－II型为KRT6b和KRT17突变所致［2－4］。近年来报道显示KRT6c基因突变也与PC的发病有关，但病例报道较少［5，6］。本研究对一患有先天性厚甲II型的家系成员进行了样本和临床资料收集，利用PCR和DNA测序法对KRT6b和KRT17基因进行检测，结果显示KRT17基因1号外显子发生突变(A92S)，报道如下。

1 材料与方法

1．1 临床资料患者家系来自山东济宁(图1)。先症者:男，7岁。双侧手足部指(趾)甲共16甲(除双手无名指和小拇指)增厚7年余。患儿足月，顺产，出生时下牙槽即有两颗牙齿，出生1个月开始出现双手足指(趾)甲增厚，随着年龄增长，指甲(趾)肥厚变黄逐渐明显。2岁时足底开始偶有水疱发生，能自行消退。体格检查:患儿一般情况好，生长发育正常，毛发正常，无心、肺、肝、脾、肾疾病。皮肤科检查:面部散在数个小米大淡黄色丘疹(图2a)。未见毛囊角化、口腔黏膜白斑、声音嘶哑和毛发异常等表现。双侧指(趾)甲呈黄褐色，由近端到远端呈楔形增厚，甲远端翘起，甲下充满硬性角质样物质(图2b);家族史:母亲患有相同甲损害，颈部、上胸部有多发性米粒至黄豆大黄白色皮下结节(图2c)。

1．2 方法

1．2．1 外周血DNA提取患者签订遗传学研究知情同意书后，对该家系2例患者和1例表型正常者进行体格检查并抽取外周静脉血5 mL。随机选取100名健康人静脉血(本实验室保存)作为正常对照组。采用全血基因组DNA提取试剂盒(QIAGEN，德国)提取基因组DNA，标化浓度至35 ng/μL，以备下一步PCR扩增和测序使用。

图1 家系图

图2 先证者母亲临床表现2a中红圈所示为先证者面部散在的淡黄色丘疹;2b先证者甲损害;2c先证者母亲临床表现

图3 3a先证者KRT17外显子第275位碱基A→G;3b先证者母亲KRT17外显子第275位碱基A→G;3c先证者父亲KRT17外显子正常;3d家系外正常对照KRT17外显子正常

表1 KRT6b和KRT17基因的引物序列

1．2．2 PCR扩增KRT6b和KRT17基因外显子扩增引物部分参考文献［7］，部分通过NCBI和UCSC网站引物设计工具自行设计(表1)。引物合成由英潍捷基(上海)贸易有限公司完成。PCR体系为25μL:2× Taq Master Mix 12．5μL，上下游引物各1μL，DNA模板1μL，双蒸水9．5μL。PCR条件:94℃预变性10 min，94℃变性30 s，59℃退火45 s，72℃延伸60 s，共35个循环，72℃终末延伸10 min。扩增产物用1．2%的琼脂糖凝胶电泳分析。

1．2．3 DNA测序与分析PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收后送华大基因有限公司进行DNA测序［AB3730XL测序仪(Applied Biosystems)］。测序峰图采用Chromas软件读取，DNA序列采用NCBI网站“Standard Nucleotide BLAST”进行序列比对分析。

2 结果

NCBI网站序列比对和DNA峰图显示，先证者及其患病母亲KRT17基因1号外显子存在错义突变(c．275A＞G，p．Asn92Ser)，KRT6b基因未发现突变。而家系其他成员及正常对照人群未发现基因突变(图3)。同时我们比对KRT17基因序列，找到该突变位置17－3780487－A－G(hg19)，查询6万人ExAC人类外显子组整合数据库(http://exac．broadinstitute．org/)，未发现该突变。

3 讨论

临床中多见的先天性厚甲主要有两型:PC－I型和PC－II型。KRT6a和KRT16突变所致的PC－I型主要表现为指(趾)甲增厚，可伴有局限性的掌跖角化过度，手足部位多汗，毛周角化和空腔黏膜白斑等临床表现;KRT6b和KRT17突变所致的PC－II型除甲损害外还可伴有胎生牙、多发性脂囊瘤、毛发异常及声音嘶哑等症状。本研究中先天性厚甲症先证者在甲损害的同时伴胎生牙和多发性脂囊瘤，结合KRT17基因突变可明确诊断为PC－II型。

角蛋白是所有真核细胞维持细胞形态的重要结构蛋白，可分为两型:I型角蛋白(KRT9－20)为酸性，位于染色体17q12－q21;II型角蛋白(KRT1－8)为碱性，位于染色体12q11q－14［8，9］。1994年Munro将PC的致病基因定位于染色体17q12－q211，随后研究逐渐发现PC的其他致病基因:KRT16、KRT17、KRT6a、KRT6b和KRT6c。角蛋白结构中的螺旋区域分为1A、1B、2A和2B四个亚区，突变位点主要集中在高度保守的螺旋起始端1A区和螺旋末端2B区［10］，此区域发生突变会影响角蛋白丝的合成、稳定及功能［11］。本研究发现的KRT17基因1号外显子上突变位点(c．275A＞G)导致蛋白质中第92位天冬氨酸变成丝氨酸，该位点正好位于角蛋白高度保守螺旋亚区1A的起始端。此突变位点在国内外均有报道［12－18］，是PC－II型较常见的突变位点。

KRTl7是I型角蛋白，在甲床、毛囊、皮脂腺等皮肤附属器中表达，正常表皮不表达［14］。研究发现N92S这一突变位点也是单纯多发性脂囊瘤的致病突变，可见同一种突变可以引起两种表型有重叠的不同疾病［19，20］。有研究报道对携带此突变位点的PC－II型患者的脂囊瘤组织进行免疫组织化学检测，发现脂囊瘤囊壁上皮细胞异常表达KRT17［21］，证实了KRTl7基因突变在不同疾病的作用。另外，多发脂囊瘤通常发生于青春期之后，而PC－II型的脂囊瘤多发生于青春期之前［17］，提示我们除了基因突变之外还有其他因素影响疾病的临床表型，如雄激素水平、生活环境等。对于先天性厚甲目前尚无有效的治疗方法，针对此类疾病的基因治疗还在研究阶段，短期内无法应用于临床。

总之，本研究在一个II型先天性厚甲家系患者中发现了KRT17基因第1号外显子上存在错义突变(c．275A＞G，p．Asn92Ser)，佐证了以往研究结果，为该病的产前咨询、基因诊断以及未来的靶点基因药物治疗奠定了理论基础。

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(收稿:2016－12－10修回:2016－12－27)

Detection of KTR gene mutations in a family with pachyonychia congenital type II

CAOJing1，SUNLele2，FUXi＇an2，WANGZhenzhen2，YUGongqi2，LIUHong2，ZHANGFuren1，2．
1．ShandongProvincialHospitalforSkinDiseases，ShandongUniversity，Jinan250022，China;2．Shandong ProvincialInstituteofDermatologyandVenereology，ShandongAcademyofMedicalSciences，Jinan250022，China
Correspondingauthors:ZHANGFuren，E－mail:zhangfuren@hotmail．com

Objective:To identify the mutations of KRT6b and KRT17 genes in a pedigree with pachyonychia congenita．Methods:Genomic DNA was extracted from peripheral blood of propositus，the parents and 100 healthy controls．The mother was a patient and his father was normal．All the exons of KRT6b and KRT17 genes were amplified by PCR，and the products were purified and directly sequenced to detect mutations．Results:A missense mutation of KRT17 gene(c．275A＞G)was identified in propositus and the mother，which was not found in the father and controls．No mutation of KRT6b was found in this family members and controls．Conclusion:A heterozygous missense mutation in KRT17(c．275A＞G，p．Asn92Ser)is the cause of the disease in the family．

pachyonychia congenita;gene mutation;KTR gene

国家自然科学基金资助项目(编号:81601387)

1山东大学附属省皮肤病医院，山东大学，山东济南，250022 2山东省皮肤病性病防治研究所，山东省医学科学院，山东济南，250022

张福仁，E－mail:zhangfuren@hotmail．com