油菜根肿病菌的生物学特征

石茗，李永冲，刘经亮，倪明龙

(广东食品药品职业学院 广东，广州 510000)

油菜和大豆、花生、芝麻并称为四大油料作物，与其他各国相比，我国油菜的种植面积及其总产量居首位。油菜根肿病俗称“大根病”，又称“油菜根癌病”，其病原菌芸薹根肿菌属于专性的寄生菌，目前广布全世界，在欧洲南部及地中海西岸最早出现，尤以温带地区发生严重[1]。我国油菜于1995年初患此病[2]，现已遍布绝大部分地区，随着外界环境恶化，此病的发病面积及危害程度正越来越大[3,4]。研究油菜根肿病菌的形态特征，为防治油菜根肿病提供依据。

1 材料与方法

1.1 油菜根肿病菌的形态特征

1.1.1 菌源于2019年3月在广东省广州市花都区油菜地采集油菜根肿病的新鲜病样本，于-20℃冰箱内保存。

1.1.2 制备休眠孢子悬浮液参考马淑青等[5]的方法，取油菜根肿组织，搅成匀浆，再经过过滤、沉淀等步骤制成休眠孢子悬浮液，于4℃冰箱内保存。

1.1.3 休眠孢子至管腔形态观察首先，将休眠孢子悬浮液滴在铜网（200目）上进行沉淀，再将多余水分吸去，接着染色（2%磷钨酸处理），将多余染液吸干后并晾干，用透射电子显微镜下观察休眠孢子形态及休眠孢子至管腔的形态演变过程并测量大小。

1.2 温度、pH值及光照与休眠孢子萌发的关系

1.2.1 温度与休眠孢子萌发的关系在灭菌的三角瓶加入的油菜根分泌物溶液10mL及1mL孢子悬浮液，pH值设置为6.3上下，在0℃～40℃间，每隔4℃设置一个温度，共设置11个温度条件，分别在无光照条件下进行培养，孢子萌发情况的观察统计于5d后进行电子显微镜下进行。

1.2.2 pH值与休眠孢子萌发的关系在灭菌的三角瓶加入的油菜根分泌物溶液10mL及1mL孢子悬浮液，在用酸度计测定pH值为2.5、3.5、4.5、5.0、6.4、7.4、8.4和9.4等8个条件下，在24℃及无光照条件下，分别进行培养，在5d后，进行电子显微镜下的孢子萌发情况的观察统计。

1.2.3 光照与休眠孢子萌发的关系在灭菌的三角瓶加入的油菜根分泌物溶液10mL及1mL孢子悬浮液，pH值设置为6.3上下，24℃条件下，将三角瓶置于光照度为900Lx的日光灯下照射24h及无光照培养24h，5d后进行电子显微镜下的孢子萌发情况的观察统计。

1.3 致死温度测定

在灭菌的三角瓶加入的油菜根分泌物溶液10mL及1mL孢子悬浮液，pH值设置为6.3上下，将三角瓶分别置于36℃、39℃、42℃、45℃、48℃、51℃、54℃和57℃等8个温度设置中，恒温水浴锅中处理10 min，分别在24℃条件下进行黑暗培养，休眠孢子的萌发情况5d后在电子显微镜下进行观察统计，在以上温度中，孢子无法萌出的最低温度，可定为致死温度。

2 结果与分析

2.1 油菜根肿病菌的形态特征

经负染色处理后，在透射电镜放大800倍下，可观察到游动孢子近肾形或近球形，大小为2.1～5.1pm，平均为3.6pm，其上着生2根长短不等的尾鞭。电镜下观察到休眠孢子至管腔形态演化进程为：在休眠孢子的孢子壁处，一个游动孢子被释放出，约20～40min后，随着游动孢子运动变得缓慢，其鞭毛逐渐脱落，而形成休止孢，同时可观察到休止孢呈圆形，大小为1.5～2.1pm，囊化的游动孢子发育出一个长管状空腔（管腔），此长管状空腔有2.8～3.3pm（平均3.11pm）长，宽为1.2～1.3 pm（平均1.24pm）。

2.2 温度、pH值和光照与休眠孢子萌发的关系

2.2.1 温度与休眠孢子萌发的关系经试验观察，休眠孢子在4℃以上、40℃以下均可以萌发，试验结果表明，24℃是休眠孢子最适宜萌发的温度，最适宜温度下，可测得孢子萌发率为67.8%，非24℃时，休眠孢子的萌发率均低于最适温度（图1）。此实验数据表明休眠孢子萌发和温度有重要关联，田间发病状况也证明了温度的影响。

2.2.2 pH值与休眠孢子萌发的关系在pH6.4～7.4条件下，休眠孢子均可以萌发，试验表明，萌发的最适为pH6.4，此pH值下，萌发率为67.5%，其他pH值下，休眠孢子的萌发率均低于最适为pH（图2）。

2.2.3 光照与休眠孢子萌发的关系经过5d光照培养的休眠孢子，测得其萌发率为11.24%，对比经过5d无光照处理的休眠孢子，其萌发率为70.13%，由此得出，光照对休眠孢子萌发有明显的抑制作用。

2.3 致死温度的测定

试验中测得休眠孢子在48℃处时的萌发率为2.46%，在51℃、54℃处理的样品液中油镜下未观察到有孢子萌发，据此可以推测51℃为油菜根肿菌休眠孢子的致死温度。

3 讨论与结论

3.1 讨论

3.1.1 油菜根肿病菌的发生1995年我国初次发现油菜根肿病[2]，根肿菌存在不同的生理小种。根肿病菌的生理小种分化在1931年被Honig首次证明,Williams系统和ECD系统是国际上广受认可的2个根肿病菌生理小种鉴别系统。

油菜根肿病菌休眠孢子的大小明显大于甘蓝根肿病菌休眠孢子[6]，导致这种状况发生的原因后续课题将针对此疑问进行探究。

3.1.2 外部条件对油菜根肿病发生的影响研究表明，在土壤温度10℃～30℃，尤其是当土温为19℃～25℃，根肿病适宜发生。因此，可适当推迟播种进而使土壤温度降低从而有效控制根肿病发生。休眠孢子致死温度为51℃。所以可以在播种前想办法使使土壤升高（例如覆盖地膜），达到致死温度杀死休眠孢子，有效预防根肿病的发生。

在pH值为6.0～6.7时，休眠孢子萌发的几率大。为了提高农作物产量而盲目施用大量化学复合肥料、大气污染及酸雨等使得土壤酸化，因此在控制根肿病时，一方面，可通过增施碱性肥料中和酸性。另一方面，增施有机肥，达到培肥地力的效果。

在有光照的情况下，休眠孢子的萌发受到明显抑制。可通过光敏色素来抑制休眠孢子萌发的进程，进而控制根肿病的发生。

3.2 结论

3.2.1 油菜根肿病菌的形态特征

油菜根肿病菌体眠孢子至管腔的演化进程为：在休眠孢子的孢子壁处，一个游动孢子被释放出，约20～40min后，随着游动孢子运动变得缓慢，其鞭毛逐渐脱落，而形成休止孢，休止孢最后萌发而形成管状结构。

3.2.2 油菜根肿病菌体眠孢子的生物学特性油菜根肿病易发生的条件是：温度为24℃，pH值为6.4，无光照。其病菌的致死温度是51℃。