GSK- 3β对正畸牙齿移动的影响

孙聪 刘文佳 金岩 金钫

正畸牙齿移动是一种对机械力的生物学反应。牙齿移动是加力装置导致牙槽骨改建的结果，应力分别会导致压力侧的骨质吸收和张力侧骨质形成。为了使牙齿移动到想要的位置，压力侧的牙槽窝形成间隙以便牙齿移动而张力侧会出现进行性的骨形成。骨的改建包括骨的吸收和骨的生成，正常骨组织这一过程是相互平衡的。正畸牙齿移动过程中压力侧破骨细胞活化破骨，牙齿向压力侧移动，张力侧形成间隙被新生骨充满[1]。正畸牙齿移动过程不仅仅和破骨细胞与成骨细胞活动相关，其复杂之处在于各种信号通路、炎症反应以及细胞因子等变化都参与其中，了解它们之间的相互关系对研究牙齿移动机制具有重要意义。

糖原合酶激酶- 3β(glycogen synthase kinase- 3，GSK- 3β) 是一种多功能的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在蛋白质合成、信号传递、细胞增殖、细胞分化、炎症反应、神经功能、肿瘤形成及胚胎发育等众多细胞进程中均扮演重要的角色。GSK- 3β能够使多种底物发生磷酸化，并参与胰岛素、Wnt、Rankl以及Hedgehog等多个信号通路的调控，在其中发挥重要作用[2]。许多研究表明GSK- 3β在炎症反应和骨改建中发挥重要作用[3-4]。因此我们引进GSK- 3β基因敲除小鼠来研究GSK- 3β在正畸牙齿移动过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

正畸用镍钛螺旋拉簧(上海埃蒙迪)，正畸测力计(奥杰G212- 01，杭州)，结扎钢丝(0.1 mm)，自制开口器，酸蚀剂(第四军医大学口腔医院)，3M粘结剂(3M Unitek，美国)，光固化灯(LY- B200，广东佛山)，器械盒(剪刀，镊子，针持，手术刀，眼科剪)，牙科气枪，戊巴比妥钠(1%)，Micro CT(GE公司，美国)。

1.2 实验动物与分组

选择10 周龄，无特定病原体动物(SPF级)，雄性C57小鼠20 只(由第四军医大学实验动物中心提供)，体重20 g左右，动物饲养于完全洁净环境下(第四军医大学组织功能工程中心动物房)。自由进食消毒固体饲料，饮消毒清水，室温控制下饲养。

实验分组：GSK- 3β基因敲除组与野生型注射LiCl，各加力3、7 d后处死，5 只/组；野生型组与GSK- 3β基因敲除组：各加力3、5、7、14 d处死，5 只/组。

1.3 基因敲除小鼠繁殖鉴定

1.3.1 基因敲除小鼠繁殖 取1 只雄性GSK- 3β基因敲除C57小鼠和2 只雌性野生型C57小鼠合笼，每天检查受孕，雌性小鼠出现精栓后分笼。产仔3 周左右进行基因鉴定，雌雄分笼。

1.3.2 基因敲除小鼠基因鉴定 待小鼠满3 周后，打耳标，取尾约1 mm，分别放入100 μl裂解液+2 μl蛋白酶K中，55 ℃水浴过夜，再调节温度85 ℃水浴1 h使蛋白失活。进行PCR扩增后凝胶剂电泳，荧光灯下观察结果(图 1)，同时含有2 个条带450 bp和333 bp的样本2、4、8为基因敲除小鼠，其余样本只含有1 个条带333 bp为野生型。

图 1 小鼠基因鉴定结果

1.4 实验方法

1%戊巴比妥钠腹腔注射全身麻醉(注射时头部朝下，回抽无血注射，防止损伤内脏)，待麻醉彻底后在手术板上固定小鼠四肢，开口器开口，酒精棉球擦洗第一磨牙(M1),气枪吹干，酸蚀剂酸蚀约40 s，酒精棉球擦洗干净，气枪吹干牙面，涂3M底胶，光固化灯照射10 s，拉簧剪4 mm左右一侧弯圈，用3M固体胶粘于M1表面，注意清洁胶体不要接触第二磨牙和牙龈，光固化灯固化40 s。同样酸蚀切牙吹干，在2 个切牙上制作树脂球，将另一侧拉簧绑在磨牙上，测力计测力，大小控制在30 g。剪断多余结扎丝，树脂球包裹切端，防止磨伤黏膜[5](图 2)。

图 2 建立小鼠正畸牙齿移动模型

50 只小鼠同样方法固定拉簧，力值大小控制为30 g，术后喂养松软食物(如面包)，每天观察小鼠体征，检查拉簧固定状况，拉簧损坏脱落及时同样方法修复。

1.5 标本采集

野生型组和GSK- 3β组根据分组在3、5、7、14 d；野生型注射LiCl组(隔天100 ng/ml)[6]3、7 d采取脱颈法处死，迅速分离小鼠上颌骨，取右侧小鼠牙及牙周组织，迅速放入4%多聚甲醛固定24 h，每组各随机取3 只扫Micro CT。然后，自来水冲洗24 h，16%EDTA脱钙，2～3 d换液1 次，脱钙3 周左右，针刺法检测脱钙状况，脱钙结束后，30%蔗糖脱水过夜，包埋液包埋，冰冻切片进行免疫荧光染色。

1.6 免疫荧光染色

冰冻切片室温下晾干30 min，PBS洗5 min×3，2%BSA37 ℃封闭60 min，置切片于湿盒内，滴加一抗(trap)4 ℃过夜，PBS洗5 min×3，滴加二抗37 ℃ 30 min，PBS洗5 min×3，用1 g/ml Hoechst染核20 min，PBS洗5 min×3，缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察或-20 ℃避光保存。

2 结 果

2.1 正畸牙齿移动距离

加力3、5、7、14 d(本实验重在观察基因敲除小鼠与野生型的差别因此分多组进行观察)的Micro CT扫描结果显示：野生型小鼠与GSK- 3β基因敲除小鼠各组内对比，牙齿明显移动，差异有统计学意义；野生型小鼠与GSK- 3β基因敲除小鼠同期相比，加力后牙齿移动距离有差异，且差异有统计学意义。基因敲除小鼠的牙齿移动距离较野生型的明显缩短(表 1)。

表 1结果显示：抑制GSK- 3β可以抑制小鼠正畸牙齿移动，而注射LiCl会产生与敲除GSK- 3β在牙齿移动方面会产生类似的效果。

表 1 野生型小鼠与GSK- 3β基因敲除小鼠牙齿移动距离

注： 野生型小鼠与GSK- 3β基因敲除小鼠各组内对比，P<0.05； 野生型小鼠与GSK- 3β基因敲除小鼠同期各组相比，P<0.05

GSK- 3β基因敲除型与野生型注射LiCl小鼠加力后取材扫描MicroCT结果显示：正畸加力后牙齿出现明显移动，统计结果显示3、7d(查阅相关文献发现应用3、7 d时间进行研究正畸牙齿移动较多；另一方面只是对比基因敲除与药物注射的区别无需长时间进行观察因此只选用2 个时间段)的GSK- 3β基因敲除小鼠与野生型注射LiCl小鼠牙齿移动距离无统计学差异(表 2)。

表 2 GSK- 3β基因敲除小鼠与野生型注射LiCl小鼠牙齿移动距离

Tab 2 Tooth movement distance of the GSK- 3 gene knockout mice and wild type mice injected with LiCl

(n=5， μm)

注： 3 d：P>0.05； 7 d：P>0.05

2.2 加力后破骨细胞变化

免疫荧光(Trap)染色结果显示：加力3d破骨细胞野生型高于基因敲除型小鼠水平；而加力7 d时破骨细胞野生型也明显高于基因敲除小鼠水平，差异有统计学意义；而GSK- 3β基因敲除组与野生型注射LiCl组相比无明显差异。此结果与Micro CT结果相一致(表 3)。

由此可得出结论:GSK- 3β可以通过改变破骨细胞的水平从而影响小鼠正畸牙齿移动。

表 3 破骨细胞数量

注： 野生型组与GSK- 3β基因敲除组相比, 3 d：P<0.05； 7 d：P<0.05； 野生型注射LiCl组与野生型注射LiCl组相比3 d：P>0.05； 7 d：P>0.05

3 讨 论

3.1 基因小鼠在正畸研究中的应用

本实验引进基因敲除小鼠和常规注射抑制剂做对比，发现基因敲除小鼠比常规注射抑制剂效果稍明显，但是差别不具有统计学意义。虽然不具有显著区别，但在以后的研究中应用基因小鼠不失为一种更好的选择，一方面可以从根本上抑制目的基因，目的蛋白，避免药物其他影响的干扰性；另一方面会使得实验更加容易操作，避免注射药物过程中导致的动物受伤，死亡等状况。谈及基因敲除动物，最佳动物是小鼠，但是在正畸牙齿移动模型中往往是应用稍大型动物，因为易于操作，然而也有其弊端，就是很难用大样本实验来说明问题。本实验尝试应用小鼠作为正畸加力模型，成功制作模型后进行加力，采取较大样本，各阶段观察的方法，较为有力的证明GSK- 3β影响正畸牙齿的移动。

3.2 GSK- 3β对正畸牙齿移动影响的潜在途径

研究表明LiCl可以通过Wnt/β- catenin信号通路增强骨的形成。LiCl通过抑制GSK- 3β增强β- catenin信号来治疗躁郁症已几十年了[7]。GSK- 3β影响牙齿移动可能通过：(1)通过Wnt等通路影响骨质改建从而影响牙齿移动。Wnt影响骨改建已经被证实。而目GSK- 3β对Wnt系统的调节方式，目前认为有如下2 种方式：①GSK- 3磷酸化β- catenin的第33 、37 、41、45位点上的丝氨酸和苏氨酸。这些位点的磷酸化对于β- catenin的降解具有重要意义。实验证明，β- catenin N- 端的缺失(缺乏以上这些位点)后在体内表现出持续的稳定，并且不影响其与a- catenin、E- cadherin以及LEF- 1/Tcf的结合。在多种肿瘤中的确发现类似的突变。②GSK- 3对β- catenin的另一个调节机制是通过对APC的调节β- catenin产生影响。GSK- 3可以经axin直接磷酸化APC。磷酸化的APC会增加其与β- catenin的结合，继而降解β- catenin。β- catenin在N- 端有一个序列，该序列是APC等的结合域。但是实验证明，缺乏APC结合区的β- catenin仍然会被APC诱导降解，这就提示我们，APC诱导β- catenin降解的作用不仅可以通过直接与β- catenin结合产生，而且可以通过其它 间接途径产生。目前推测这种间接途径是经conductin/axin对β- catenin产生影响[8]。(2)通过NF- κB等通路影响炎症反应的过程从而影响正畸过程中的破骨启动。目前对于GSK- 3β在该系统中的具体调节机制并不清楚，但实验证实，在NF- κB系统中，如果出现GSK- 3β的缺失，将会出现细胞对TNF诱导的细胞凋亡非常敏感[9]。而TNF是正畸牙齿移动过程中非常重要的细胞因子。(3)影响巨噬细胞的极化来影响牙齿移动。周彦恒等[10]发现当在正畸牙齿移动过程中注射巨噬细胞抑制剂时，牙齿移动距离和破骨细胞量明显减少；而当在正畸牙齿移动过程中注射M1型巨噬细胞时牙齿移动近距离明显增加。而且GSK- 3β是巨噬细胞极化过程中的重要调节因子[11]。(4)通过影响神经效应进而改变过改建。周彦恒等[12]发现神经系统可以影响正畸牙齿移动过程，而且GSK- 3β在神经发育方面也有重要作用[3]。

3.3 展望

正畸牙齿移动的主要影响因素还未明确，如今研究重点大多放在各种药物如何影响破骨上，而巨噬细胞被认为是破骨细胞的前体细胞，而且周彦恒等的最新研究发现巨噬细胞的极化可以影响正畸牙齿移动过程中的破骨和牙根吸收，这正好和GSK- 3β的效果相符，而且GSK- 3β是巨噬细胞极化过程中的重要调节因子，丁寅等研究也发现在正畸大鼠牙齿移动过程中iNOS发生显著变化[13]，而iNOS是巨噬细胞极化的相关因子，因此下一步研究可以重点放在GSK- 3β是否影响巨噬细胞极化上，这不仅有利于对正畸过程的进一步研究，而且对于巨噬细胞的研究也有重要意义。