超声波协同酶法提取锦灯笼果实多糖工艺的研究*

闫 平，张 彦，张 寒，申旭霁，张明慧

(西安医学院 药学院，陕西 西安 710021)

锦灯笼是茄科植物酸浆干燥宿萼或带果实的宿萼。宿萼味苦，气微，果实味甘，性寒，微酸，具有清热解毒、利咽化痰、利尿等作用；外治天疱疮、湿疹。锦灯笼主要化学成分含有甾体类、生物碱类、黄酮类、多糖、丰富的矿物元素和维生素以及多种氨基酸[1-2]。

有研究表明多糖都具有免疫调节、降血糖、降血脂、抗肿瘤等诸多功效[3-4],植物多糖结构复杂，种类多样，且常与蛋白质、脂质等结合成多糖复合物，给多糖的提取分离带来一定困难，加之多糖的提取方法和工艺尚未成熟以及效率、成本等多方面的考虑，所以选择一种合适的提取分离方法对多糖的研究具有重大意义[5]。植物多糖凭借其独特的生物活性、相对稳定性、耐热冷性和水溶性等，在保健品、功能饮料、冰淇淋等食品行业及药品行业都得到了越来越多的应用[6-8]。目前尚未有以超声波协同纤维素酶法提取锦灯笼果实多糖方面的研究报导。故实验采用超声波协同纤维素酶法对锦灯笼果实多糖提取工艺进行优化[9]。超声波与酶联合提取多糖，通过将两种方法结合提取多糖的方式，大大加速了多糖的溶出，具有条件温和、杂质易除和提取率高等优点。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

锦灯笼：由西安医学院药学院生药教研室冯永辉教授鉴定；D-无水葡萄糖对照品：110833-201205，中国食品药品检定研究院；纤维素酶：10 000 U/g，成都艾科达化学试剂有限公司；苯酚、硫酸、氢氧化钠等均为分析纯，市售。

电子天平：SQP，北京赛多利斯科学仪器有限公司；超声波清洗器：KQ-250B，昆山市超声仪器有限公司；电热恒温水浴锅：DZKW-D-2，北京市永光明医疗仪器厂；循环水式真空泵：SHZ-D(Ⅲ)，巩义市予华仪器有限责任公司；干燥箱：101-1，上海市实验仪器总厂；紫外-可见分光光度计：UV-160A，上海精密仪器厂；酸度计：PHS-3C，上海佑科仪器仪表有限公司。

1.2 实验方法

称取5 g锦灯笼干燥果实，加入一定量的纤维素酶再加入一定量的纯化水，然后调节pH。在超声波提取后水浴酶解，水浴酶解后90 ℃灭酶30 s，抽滤，得到锦灯笼果实多糖提取液[10]。

1.3 锦灯笼多糖含量测定

1.3.1 标准溶液的配制

精密称取无水葡萄糖对照品12.5 mg，置250 mL容量瓶中，加纯化水适量溶解，然后稀释至刻度，摇匀，即得0.05 mg/mL的对照品溶液，现用现配。

1.3.2 苯酚溶液的配制

精密称取苯酚5.001 1 g，加纯化水稀释，待完全溶解，定容至100 mL( 棕色瓶保存),w(苯酚)=5%，放置冰箱内储存备用。

1.3.3 标准曲线的制备

精密量取1.3.1节标准品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别置10 mL具塞试管中，然后加纯化水补至2.0 mL，再各精密加入配制好的苯酚溶液1 mL，摇匀，迅速精密加入浓硫酸5 mL，摇匀，放置10 min。置40 ℃水浴中保温15 min。取出，迅速在冰水浴中冷却至室温，然后在490 nm的波长处测定吸光度。以吸光度值A为纵坐标，ρ(葡萄糖)(mg/mL)为横坐标，绘制标准曲线。得出回归方程：y=68x+0.251 8，R2=0.998 3。

1.3.4 样品分析

精密量取1.0 mL锦灯笼果实提取液用纯化水定容至250 mL，然后精密量取1.0 mL稀释后的溶液，置10 mL具塞试管中，再加纯化水1.0 mL。照标准曲线的制备项下的方法，依法测定吸光度。即各精密加入配制的苯酚溶液1 mL，摇匀，迅速精密加入浓硫酸5 mL，摇匀，放置10 min。置40 ℃水浴中保温15 min。取出，迅速在冰水浴中冷却至室温，然后在490 nm的波长处测定吸光度。从标准曲线上得出供试品溶液中含葡萄糖的质量，计算提取率[11]。

锦灯笼多糖提取率(%)=nρV0/1 000m×100%

式中，n为稀释倍数；ρ为锦灯笼多糖提取液的质量浓度，mg/mL；V0为锦灯笼样品液的总体积，mL；m为称取的锦灯笼干燥果实的质量，g。

1.3.5 单因素实验

称取锦灯笼干燥果实5.0 g，预设料液比(锦灯笼粉末的质量∶水的体积，下同)1∶10 g/mL、w(纤维素酶)=3%、超声时间30 min、酶解时间60 min、pH=4.0、超声温度50 ℃、酶解温度50 ℃为工艺流程中的常规量，以料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 g/mL)、w(纤维素酶)(1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%)、超声时间(10、20、30、40、50、60 min)、酶解时间(30、40、50、60、70、80 min)、pH值(2、3、4、5、6、7)、超声温度(30、40、50、60、70 ℃)6个单因素变量替换工艺流程中相应的常规量，按照1.2和1.3.4实验步骤提取和测定，然后计算锦灯笼提取液多糖得率。

1.3.6 显著因素的筛选设计

根据单因素实验确定的料液比、w(纤维素酶)、超声时间、酶解时间、pH值、超声温度6个影响因素的最适条件范围，采用Minitab 17软件进行因素水平设计见表1。

表1 Plackett-Burman实验设计因素水平表及编码

1.3.7 响应面法优化实验设计

利用Box-Behnken实验设计原理[12-14]，以Plackett Burman实验确定的4个对锦灯笼多糖得率影响显著的因素，使用Design-Expert8.0.6软件进行四因素三水平的实验设计(见表2)，建立数学回归模型并分析。

表2 响应面分析因素与水平编码

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

各因素对锦灯笼多糖得率影响情况见表3、表4。

表3 不同处理组对锦灯笼多糖得率的影响

表4不同处理组对锦灯笼多糖得率的影响

酶解时间/min多糖得率/%pH值多糖得率/%超声温度/℃多糖得率/%302.5142.45403.24402.8653.54503.71503.1263.15603.54603.5173.36703.18703.54803.62

由表3、表4可见，综合数据以及能源消耗等方面考虑，料液比选择1∶10～1∶20 g/mL较为适宜。

酶催化的实质是酶与底物相结合，从而减小反应物的活化能，提高反应的速率。所以，反应速率在很大程度上是取决于酶与底物复合物形成的速率。从酶解效果以及耗材等方面考虑，w(纤维素酶)选在2%～4%较为适宜[15]。

从数据可以看出，超声时间在30 min时锦灯笼多糖的得率达到最大。综合能耗等问题，超声时间选择在20～40 min较为适宜。

酶解时间从生产效率等方面考虑酶解时间选择在50～70 min较为适宜。

pH值不同会使得酶与底物结合的速度也不同，这可能是由于酸碱度会影响酶的催化速度以及酶自身的活性。因此，pH值选择4.0～6.0较为合适。

由数据可以得出，当提取温度过高时，锦灯笼多糖的提取率会随着温度的升高而下降。因此，超声温度选择在40～60 ℃较为适宜。

2.2 Plackett Burman实验设计及筛选关键因素结果

对表1进行实验设计及结果效应评价，结果见表5、表6。

表5 Plackett Burman实验设计及响应值

表6 Plackett Burman实验设计各因素效应评价

1) **表示极显著(P<0.01)；*表示显著(P<0.05)；P>0.05为不显著。

由表6的结果可以看出，影响锦灯笼多糖得率的因素从强到弱排序依次为：C>A>B>D>F>E。其中超声时间对锦灯笼多糖得率的影响达到极显著水平，料液比、纤维素酶添加量和酶解时间达到显著水平，而超声温度和pH值对锦灯笼多糖得率的影响不显著。因此，选择超声时间、料液比、纤维素酶添加量和酶解时间这四个因素作为四因素三水平的响应面法优化设计和分析的因素。根据数据分析和节约成本等原则，将超声温度和pH值这两个因素固定在较好水平上，即超声温度为50 ℃，pH值为5.0进行后续实验。

2.3 锦灯笼多糖提取响应面法优化结果

在Plackett Burman实验结果的基础上，考察A、B、C、D 对应的x1、x2、x3、x4四个变量对锦灯笼多糖得率的影响，采用响应面法进行优化，结果见表7。

表7 响应面法优化实验方案及结果

式中，Y为锦灯笼多糖得率，%。

进一步对该模型及回归系数进行显著性分析，结果见表8。

表8 回归方程各项的方差分析

1) 同表6。

由软件对回归模型进行数学分析获得锦灯笼多糖得率的最佳条件为料液比1∶15.586g/mL、w(纤维素酶)为3.4%、超声时间29.97min和酶解时间59.73min，在此条件下，预测锦灯笼多糖的得率最大理论值为13.91%。

2.4 优化条件下锦灯笼多糖得率的验证结果

考虑到实际操作的方便性，将上述最佳条件调整为料液比1∶15.6g/mL、w(纤维素酶)=3.4%、超声时间30min和酶解时间60min，并结合pH=5.0，超声温度50 ℃进行3次平行锦灯笼多糖提取实验，锦灯笼多糖得率(13.77%、13.80%、13.78%)平均值为13.78%。实际值与预测值的RSD(相对标准差)为0.467%，差异不显著。因此，采用响应面法优化得到的参数基本准确可靠，具有一定的实用价值。

3 结 论

在超声波协同酶法提取锦灯笼多糖的过程中，料液比、酶添加量、超声时间、酶解时间、pH值、超声温度等因素均对提取率有影响。通过单因素实验、PlackettBurman实验和响应面法优化实验对超声波协同酶法提取锦灯笼果实多糖的工艺条件进行优化。得到影响锦灯笼多糖得率的4个显著因素，以及最佳提取工艺条件参数为料液比1∶15.6g/mL、w(纤维素酶)=3.4%、超声时间30min、酶解时间60min、pH=5.0和超声温度50 ℃，锦灯笼多糖得率平均为13.78%，与预测值(13.91%)的相对标准差为0.467%，差异不显著。

结果表明超声波协同酶法具有高效、省时等优点，为纤维素酶法联合超声波处理技术在锦灯笼多糖提取过程中的应用提供了理论依据。

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