从氧化应激角度探讨清肾颗粒对肾间质纤维化大鼠的干预作用

王亿平 陈芳 王东 任克军 金华 王立媛

安徽中医药大学第一附属医院 合肥 230031

从氧化应激角度探讨清肾颗粒对肾间质纤维化大鼠的干预作用

王亿平 陈芳 王东 任克军 金华 王立媛

安徽中医药大学第一附属医院 合肥 230031

[目的]观察肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis,RIF）大鼠肾组织中活性氧（reactive oxygen species,ROS）、丙二醛（malondialdehyde,MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）的表达，探讨清肾颗粒对RIF大鼠氧化应激的影响。[方法]采用单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction,UUO）建立RIF模型，将60只SD大鼠随机分为清肾颗粒组（n=12）、坎地沙坦组（n=12）、模型组（n=13）、假手术组（n=12）和正常组（n= 11）。因感染、麻醉药过量、手术损伤等原因死亡12只大鼠，最后进入数据分析有48只大鼠，即清肾颗粒组（n=10）、坎地沙坦组（n=10）、模型组（n= 8）、假手术组（n=9）和正常组（n=11）。清肾颗粒组予清肾颗粒水溶液0.4g/(100g·d)灌胃，坎地沙坦组予坎地沙坦水溶液0.05g/(100g·d)灌胃，模型组、假手术组及正常组每日给予等量生理盐水灌胃，疗程均为4周。检测各组大鼠血尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）、肌酐（serum creatinine,Scr）和24h尿蛋白定量（24h urinary protein,U-Pro/24h），采用双抗体夹心酶联免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）法检测大鼠肾组织中ROS、MDA、SOD含量。[结果]清肾颗粒组、坎地沙坦组、模型组BUN、Scr、U-Pro/24h、ROS、MDA水平均高于正常组和假手术组（P<0.01），SOD水平均低于正常组和假手术组（P<0.01）；与模型组比较，清肾颗粒组和坎地沙坦组BUN、Scr、U-Pro/24h、ROS、MDA水平明显降低（P<0.01），SOD水平明显升高（P<0.01），清肾颗粒组优于坎地沙坦组（P<0.05）。[结论]清肾颗粒可以降低UUO大鼠肾组织中ROS、MDA，升高SOD水平，减轻肾组织中氧化应激反应，提高抗氧化能力，进而发挥抗RIF作用。

RIF；清肾颗粒；ROS；MDA；SOD；单侧输尿管梗阻；氧化应激

终末期肾脏病（end stage renal disease,ESRD）发病率逐年升高，虽然肾脏替代治疗已取得较大的进展，但是患者庞大的医疗费用仍不容乐观。慢性肾脏病（chronic kidney disease,CKD）终将导致ESRD的

发生，其病理基础是肾小球硬化和肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis，RIF）。研究证实氧化应激在RIF过程中发挥重要的作用[1-2]。清肾颗粒作为我院院内制剂，前期研究[3-7]显示其有较好的治疗效果。本研究采用单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction, UUO）方法制作RIF大鼠模型，观察大鼠肾组织中活性氧（reactive oxygen species,ROS）、丙二醛（malondialdehyde,MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）的表达及中药清肾颗粒对其干预作用，现报道如下。

1 材料

1.1 实验动物 选用清洁级雄性SD大鼠60只，体质量（200±20）g，购自安徽医科大学实验动物中心，合格证号：SCXK（皖）2011-002。动物房温度维持在20℃～23℃，湿度维持在45%～60%。

1.2 实验药物与试剂 清肾颗粒由生大黄8g、猪苓10g、丹参30g、白花蛇舌草30g、益母草20g、茵陈20g、茯苓10g、车前草10g、白豆蔻10g、薏苡仁15g、扁豆10g、白术10g、泽泻10g、黄连10g组成，安徽中医药大学第一附属医院制剂中心加工而成，每袋颗粒剂10g，配制成1mL含0.4g清肾颗粒水溶液（生产批号：BZ20140816）；坎地沙坦：规格4mg/片，重庆圣华曦药业有限公司生产，配制成1mL含0.05g坎地沙坦水溶液（国药准字H20030771）。ROS、MDA及SOD的双抗体夹心酶联免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）法试剂盒均来源于上海源叶生物技术有限公司，生产批号分别为10321R、10417R、10256R。

2 方法

2.1 模型制作及分组 60只SD大鼠随机选择11只大鼠作为正常组，其余49只大鼠制作模型。采用UUO法制作RIF大鼠模型[8]，操作步骤如下：SD大鼠麻醉后选择左侧背部肋下约0.5cm为切口，局部剃毛、消毒，依次切开皮肤、肌层至腹腔，游离左侧肾脏和输尿管，结扎输尿管两端后，剪断输尿管，逐层缝合皮肤。假手术组仅分离左侧输尿管，不结扎，逐层缝合皮肤。49只大鼠随机分为清肾颗粒组12只、坎地沙坦组12只、模型组13只、假手术组12只。

2.2 给药方法 各组大鼠均在造模后次日开始灌胃，1次/d。按照文献[9]剂量给药，清肾颗粒组每日按0.4g/100g予清肾颗粒水溶液灌胃；坎地沙坦组每日按0.05g/100g予坎地沙坦水溶液灌胃；模型组、假手术组及正常组每日予等量温水灌胃。疗程均为4周。

2.3 观察指标 各组大鼠造模后4周处死，处死前1d用代谢笼收集24h尿液，检测24h尿蛋白定量（24-hour urinary protein,U-Pro/24h）；腹主动脉取血，采用常规生化法检测血尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）、肌酐（serum creatinine,Scr）；处死后留取术侧肾脏，一半置于液氮瓶中保存，ELISA法检测ROS、MDA、SOD含量，另一半置于4%的多聚甲醛中固定，用于苏木精-伊红（hematoxylin eosin,HE）染色和马松（Masson）染色。

2.4 统计学方法 数据采用SPSS19.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析。若资料不符合正态分布或方差齐性，则采用非参数检验。P＜0.05表示具有统计学意义。

3 结果

3.1 一般情况比较 由于感染、麻醉药过量、手术损伤等导致12只大鼠死亡，最后进入数据分析有48只大鼠，即清肾颗粒组10只、坎地沙坦组10只、模型组8只、假手术组9只、正常组11只。随着灌胃天数增加，模型组大鼠精神差，动作迟缓，活动和进食少，体毛干枯，体重减轻。而清肾颗粒组大鼠精神稍差，活动量、摄食量增加，体毛较模型组光泽，体重较稳定。坎地沙坦组表现介于清肾颗粒组与模型组之间。假手术组大鼠，术后前2d精神稍差，后如正常组大鼠一样，精神良好，反应灵敏。

3.2 各组大鼠HE和Masson染色比较

3.2.1 HE染色结果 正常组、假手术组肾小管和肾小球大小、结构正常。模型组肾小管、集合管扩张呈囊状，管腔塌陷，上皮细胞坏死，肾间质有巨噬细胞、淋巴细胞浸润和成纤维细胞增生。与模型组比较，清肾颗粒组肾小管轻度扩张，肾小囊扩张，仍保留部分正常的肾小管和肾小球结构。坎地沙坦组介于模型组与清肾颗粒组之间。见图1。

3.2.2 Masson染色结果 正常组、假手术组胶原染色主要位于小管基底膜及其周围，小管间质染色较少。模型组肾间质蓝染胶原纤维沉积明显、炎性细胞浸润增多。清肾颗粒组肾间质蓝染胶原纤维沉积及炎性细胞浸润较模型组明显减少，而坎地沙坦组介于清肾颗粒组及模型组之间。见图2。

图1 各组大鼠肾脏HE染色(200×)Fig.1 The HE staining of renal tissue in each group(200×)

图2 各组大鼠肾脏Masson染色（200×）Fig.2 The Masson staining of renal tissue in each group(200×)

3.3 各组大鼠BUN、Scr和U-Pro/24h水平比较 模型组、清肾颗粒组、坎地沙坦组大鼠BUN、Scr、U-Pro/ 24h水平均高于正常组及假手术组（P＜0.01）；与模型组比较，清肾颗粒组和坎地沙坦组BUN、Scr、U-Pro/ 24h水平明显降低（P＜0.01），清肾颗粒组下降幅度优于坎地沙坦组（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠BUN、Scr和U-Pro/24h水平比较（±s）Tab.1 The comparison of BUN,Scr and U-Pro/24h among all groups（±s）

表1 各组大鼠BUN、Scr和U-Pro/24h水平比较（±s）Tab.1 The comparison of BUN,Scr and U-Pro/24h among all groups（±s）

注：与正常组比较，▲▲P<0.01；与假手术组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01；与坎地沙坦组比较，△P<0.05。Note:compared with the normal group,▲▲P<0.01;compared with the sham operation group,**P<0.01;compared with the model group,##P<0.01;compared with candesartan cilexetil group,△P<0.05.

组别 N BUN（mmol·L-1） Scr（umol·L-1） U-Pro/24h(mg/24h）正常组假手术组模型组坎地沙坦组清肾颗粒组11 9 8 1 0 10 4.20±0.57 4.15±0.58 9.38±1.37▲▲**7.25±1.32▲▲**##6.08±1.01▲▲**##△48.60±4.71 50.37±6.66 94.27±16.47▲▲**71.94±9.76▲▲**##62.92±5.83▲▲**##△306.24±68.38 315.65±26.42 629.99±104.80▲▲**508.53±53.14▲▲**##442.80±68.34▲▲**##△

3.4 各组大鼠肾组织中ROS、MDA及SOD水平比较模型组、坎地沙坦组和清肾颗粒组ROS、MDA水平均高于正常组和假手术组（P＜0.01），SOD水平均低于正常组和假手术组（P＜0.01）；与模型组比较，清肾颗粒组和坎地沙坦组ROS、MDA水平明显降低（P＜0.01），SOD水平明显升高（P＜0.01），清肾颗粒组优于坎地沙坦组（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠肾组织中ROS、MDA及SOD水平比较（±s）Tab.2 The comparison in kidney tissue between each group of ROS,MDA,SOD levels（±s）

表2 各组大鼠肾组织中ROS、MDA及SOD水平比较（±s）Tab.2 The comparison in kidney tissue between each group of ROS,MDA,SOD levels（±s）

注：与正常组比较，▲▲P<0.01；与假手术组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01；与坎地沙坦组比较，△P<0.05。Note:compared with the normal group,▲▲P<0.01;compared with the sham operation group,**P<0.01;compared with model group,##P<0.01;compared with candesartan cilexetil group,△P<0.05.

组别 N ROS（IU·mL-1） MDA（nmol·mL-1） SOD（ng·mL-1）正常组假手术组模型组坎地沙坦组清肾颗粒组11 9 8 1 0 10 194.56±81.37 197.27±102.09 497.53±75.56▲▲**377.89±64.32▲▲**##285.81±82.00▲▲**##△2.33±0.43 2.21±0.66 3.64±0.32▲▲**3.03±0.55▲▲**##2.82±0.47▲▲**##△202.91±23.39 204.91±31.48 132.36±10.54▲▲**163.87±22.81▲▲**##178.33±15.46▲▲**##△

4 讨论

RIF以肾小管萎缩、细胞外基质积聚和肾间质的慢性炎细胞浸润为特征，与肾功能的减退密不可分[10-13]。自从2002年Iwano等[14]学者首次建立UUO小鼠模型，现此模型已成为公认的RIF模型，可以较为准确反映人类梗阻性肾病和肾脏纤维化发展过程。氧化应激是导致细胞损伤、衰老和死亡的重要原因之一。正常情况下，体内氧化与抗氧化系统维持动态平衡。当机体发生病变时，此平衡状态被打破。体内氧化系统主要是机体产生的ROS，抗氧化系统包括SOD、过氧化氢酶等。在肾脏，ROS可以直接对各类肾细胞产生直接损伤作用；亦可诱导足细胞凋亡或坏死，破坏肾小球滤过膜，是产生蛋白尿的主要危险因素[15-16]。另外，ROS还可以通过刺激系膜细胞中纤溶酶原激活剂抑制物I的表达，使系膜细胞降解细胞外基质的能力降低，促进肾内基质重构、纤维化和肾小球硬化[17]。SOD活力的高低能间接反应机体清除氧自由基的能力，而MDA的高低又能间接反应机体细胞受到自由基攻击损伤的严重程度，因此常用MDA与SOD来评价机体抗氧化应激的水平。

研究发现[8]UUO模型肾小管间质病变中氧化应激增加，氧化应激反应产物的增加可能在UUO模型肾小管间质病变中有重要的作用。张晓喧等[18]将大鼠行UUO造模10d后，发现梗阻侧肾脏肿大、肾实质变薄，肾间质水肿，弥漫炎细胞浸润，肾小管扩张或萎缩，部分肾小管腔内有蛋白或细胞管型，间质趋于纤维化；与假手术组相比，UUO组梗阻侧肾脏病理改变明显，且肾组织中羟脯氨酸和MDA含量增加，SOD活性下降，说明氧化应激参与UUO模型肾脏纤维化的形成。邓尧等[19]将60只雄性SD大鼠随机分为UUO组、人参皂苷组、模型组和科素亚组，并进行单侧输尿管结扎，结果发现UUO模型组ROS、MDA含量分别在3d、7d、14d均较假手术组升高，SOD含量较假手术组降低，说明UUO模型中存在氧化应激。

清肾颗粒主要由生大黄、薏苡仁、白术、丹参等药物组成，具有清热化湿祛瘀之功效。方中生大黄为君药，具有清热泄浊之功；黄连、白花蛇舌草、茵陈为臣药，助君药加强清热利湿之力；佐以扁豆、白豆蔻、薏苡仁、茯苓、猪苓、泽泻、白术、车前草益气健脾、渗水利湿，丹参、益母草活血化瘀亦为佐药。大黄酸是中药大黄提取的蒽醌类衍生物，研究发现大黄酸具有广泛的药理作用，有改善及部分抗氧化、抗炎、调脂等作用，且不良反应轻微，此外，它还具有抑制成纤维细胞增殖及胶原合成，改善肾脏纤维化的作用[20]。中药黄连亦具有抗氧化作用，可能与清除氧自由基、减轻脂质过氧化反应、增强抗氧化酶活性等途径有关[21]。研究发现[22]丹参有效成分丹参酮ⅡA可以影响人肾小球系膜细胞晚期糖化终产物受体的表达及改善氧化应激的水平。

本研究结果显示，模型组、坎地沙坦组和清肾颗粒组大鼠ROS、MDA水平均高于正常组和假手术组，SOD水平均低于正常组和假手术组（P＜0.01），说明UUO模型大鼠体内存在氧化应激反应。与模型组比较，清肾颗粒组和坎地沙坦组ROS、MDA水平明显降低（P＜0.01），SOD水平明显升高（P＜0.01）；亦可降低BUN、Scr、U-Pro/24h水平及减轻UUO模型大鼠肾组织的病理改变程度（P＜0.01），且清肾颗粒组优于坎地沙坦组（P＜0.05）。表明清肾颗粒可以改善UUO大鼠肾功能和肾脏病理损害的程度，减少24h尿蛋白定量，减轻肾脏组织中氧化应激反应，提高抗氧化能力，进而发挥抗RIF作用。

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Based on Oxidative Stress Mediated Mechanism to Explore the Intervention of Qingshen Granule Ageinst Renal Fibrosis

WANG Yiping,CHEN FangWANG Dong,et al First Affiliated Hospital of Anhui University of TCM,Hefei(230031)

[Objective]Through the detection of unilateral ureteral obstruction(UUO)induced renal interstitial fibrosis(RIF)in the renal tissue of rats reactive oxygen species(ROS),malondialdehyde(MDA)and superoxide dismutase(SOD)expression level to explore the intervention of Qingshen granule with oxidative stress.[Method]Used unilateral ureteral obstruction method(UUO)to model rats,60 SD rats randomly divided into Qingshen granule group(n=12), candecartan cilexetil group(n=12),model group(n=13),sham operation group(n=12)and normal group(n=11).Due to infection,injury,surgical anesthetic overdose deaths in 12 rats,and finally into the data analysis of 48 rats,Qingshen granule group(n=10),candecartan cilexetil group(n=10),model group(n=8), sham operation group(n=9)and normal group(n=11)Qingshen granule group were given Qingshen granule 0.4g(100g·d)gavage,candecartan cilexetil group were given candecartan cilexetil capsule 0.05g/(100g·d)gavage,model group,sham operation group and the normal group were given the same amount of normal saline per day orally,for 4 weeks.The rats serum creatinine(Scr),blood urea nitrogen(BUN)and 24h urinary protein(U-Pro/24h)level were detected. Using enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)to detect the renal tissue of rats ROS,MDA and SOD.[Results]Qingshen granule group,candecartan cilexetil group,model group BUN,Scr,U-Pro/24h,ROS and MDA were higher compared with normal group and sham operation group(P<0.01),the level of SOD was lower(P<0.01).Compared with model group,Qingshen granule group and candecartan cilexetil group,the levels BUN,Scr,U-Pro/24h,ROS and MDA were significantly lower(P<0.01),the level of SOD was higher(P<0.01),Qingshen granule group was better than the candecartan cilexetil group(P<0.05). [Conclusion]Qingshen granule can reduce the renal tissue of ROS and MDA,rise the renal tissue of SOD,relieve oxidative stress of kidney and prevent or mitigate the occurrence and development of renal fibrosis.

renal interstitial fibrosis;Qingshen granule;reactive oxygen;malondialdehyde;superoxide dismutase;unilateral ureteral obstruction;oxidative stress

R331

A

1005-5509（2017）02-0156-06

10.16466/j.issn1005-5509.2017.02.017

2016-09-30）

国家自然科学基金项目（81473673、81403372）；安徽省自然科学基金项目（1508085MH198）

Fund projects:National Natural Science Foundation of China(81473673,81403372);Natural Science Foundation of Anhui Province(1508085MH198)