肺炎支原体培养镜下观察与其CCU相关性分析

吴振起 ，马 融，岳志军， 魏 巍

(1.天津中医药大学，天津 300193;2.辽宁中医药大学 附属医院，辽宁 沈阳 110032)

肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae，MP)是各年龄段儿童急性上、下呼吸道感染的常见病原，其年感染发病率为9.6%～66.7%，每隔3～8 a流行一次，并可在密闭环境如学校、幼托机构、夏令营等暴发[1-2]。随着大环内酯类耐药的日益严峻，难治性MP肺炎病例有逐年增加的趋势[3]。MP感染严重影响儿童的身体健康，已引起国内外研究者广泛关注。开展MP相关基础研究迫在眉睫，而MP的培养和菌力判定是限制MP研究的瓶颈问题之一。MP菌力及浓度的判定往往借助于颜色改变单位(colour change unite，CCU)的测定。已测定CCU的MP经过冻存-复苏-培养-传代-培养……，其CCU往往发生了变化。为验证能否在MP培养的过程中，通过倒置显微镜下观察MP的浓度和分布，估算其CCU，本研究通过镜下观察MP培养浓度和分布范围，确定其分级，并与测定的CCU和实时荧光定量PCR(FQ PCR)测定结果进行关联，并进行相关性分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 MP标准株FH由辽宁中医药大学附属医院病毒室保存。

1.1.2 培养基 液体培养基主要成分为PPLO培养基、无菌胎牛血清、新鲜酵母浸液、葡萄糖、青霉素和酚红等(调整pH值为7.6左右)。

1.1.3 实验材料 FQ PCR 试剂盒(中山大学达安基因股份有限公司),内参是GAPDH(三磷酸甘油醛脱氢酶)，H1: 5′-GACATCAAGAAGGTGGTGAAGC-3′，H2: 5′-TGGAAATTGTGAGGGAGATGC-3′，扩增特异片段长度为336 bp，胎牛血清(Hyclone)。

1.1.4 仪器设备 倒置荧光显微镜(Leica LEZTDML)，低温高速离心机(德国BIOFUGE28RS)，实时荧光定量PCR仪(罗氏LCⅡ)，超低温冰箱(日本MDF-382E)。

1.2 方法

1.2.1 MP菌株培养及菌落测定 将冻存的MP接种至液体培养基中，并在37 ℃,含5% CO2、饱和氮的厌氧培养箱中孵育，培养液颜色由红变黄时进行连续传代，取第3代。以培养基由红色变为黄色时的最高稀释度作为CCU，采用CCU/mL方法测定MP浓度，取菌液浓度1×106CCU/mL备用。

1.2.2 倒置荧光显微镜观察 采用倒置显微镜(10×20倍)观察细胞瓶中的MP，同样条件下观察10个视野，取均值。自拟MP培养分级标准：成簇MP占视野≥50%，或单个MP占视野≥75%为“++++”；成簇MP占视野20%～50%，或单个MP占视野50%～75%，为“+++”；成簇MP占视野≤20%，或单个MP占视野30%～50%，为“++”；单个MP占视野≤30%，为“+”；没有MP，为“-”。其中“++++”“+++”“++”“+”培养基均发生颜色改变，即由红色变为黄色，“-” 培养基无变化。

1.2.3 实验方法 取不同冻存时间的MP菌液，分为A、B、C、D四组，利用10倍稀释法将待测菌液以培养基稀释成1×10-1～1×10-6等一系列浓度，共24组。每天观察培养基的颜色变化，经37 ℃恒温培养10 d。采用目测法测定各组的CCU。采用FQ PCR检测MP。取菌液0.2 mL，加入4倍体积生理盐水，吸取至1.5 mL灭菌离心管，12 000 r/min离心5 min，去上清液。沉淀物中加试剂盒所配DNA提取液50 μL，振荡混匀，沸水浴10 min，12 000 r/min离心5 min，取上清液2 μL，加入DNA扩增反应管中，5 000 r/min离心10 s，上机进行DNA扩增。结果判断由仪器自动给出。

1.2.4 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件处理，使用等级相关分析方法Kendall法及Spearman法进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 倒置显微镜下MP观察结果与CCU、FQ PCR检测结果

倒置显微镜(20×10倍)观察细胞瓶中的MP生长情况，在培养的第10天，所有细胞瓶的培养基均发生颜色改变，其中“++++”8 瓶，“+++”～“++++”1瓶，“+++”5 瓶，“++” 5瓶，“+”5 瓶，“-” 0瓶。见表1、2和图1。

图1 MP FQ PCR检测结果Fig.1 The test result of FQ PCR for MP

样本稀释倍数镜下观察结果CCU测定值FQPCR测定值A101+10-12.696E+10102++10-22.362E+11103++10-37.785E+10104+++10-51.750E+11105+10-22.084E+10106++10-25.794E+10B101+++10-41.800E+11102++10-23.598E+10103++++10-52.827E+11104++++10-61.995E+11105++++10-52.928E+11106+++10-56.932E+10C101+10-13.172E+10102++10-27.276E+10103++++10-72.622E+11104++++10-67.918E+11105++++10-63.269E+11106++++10-51.348E+11D101+10-14.884E+10102++++10-22.961E+11103+++～++++10-52.429E+11104+++10-42.269E+11105+++10-52.473E+11106+10-22.318E+10

表2 MP倒置显微镜分级结果对应FQ PCR检测结果Table 2 The grading results under MP inverted microscope and corresponding results to FQ PCR(±s)

2.2 MP倒置显微镜分级结果与FQ PCR结果相关性分析

通过等级相关分析(Kendall法和Spearman法)，Kendall相关系数为0.738，P值为0.000，Spearman相关系数为0.858，P值为0.000，证明与FQ PCR值显著相关，呈正比直线相关关系。从散点趋势图也可看出散点存在显著的直线趋势。见图2、3。

图2 MP倒置显微镜下观察结果与FQ PCR值散点趋势图Fig.2 The Microscope Observation of Mycoplasma pneumoniae culture and the scatter plot of FQ PCR

图3 MP倒置显微镜下观察结果与FQ PCR值Fig.3 The Microscope Observation of Mycoplasma pneumoniae culture and the value of FQ PCR

通过直线回归方差分析，F=19.851，P=0.000，可认为y与x之间有线性回归关系。直线回归方程的截距a=-8E+10,检验统计量为t=-1.294，P=0.209；回归系数b=1E+11，检验统计量为t=4.455,P=0.000,因此回归方程为y=1E+11x。

2.3 镜下观察结果与CCU测定值的幂指数相关性分析

通过等级相关分析(Kendall法和Spearman法)，Kendall相关系数为-0.788，P值为0.000，Spearman相关系数为-0.847，P值为0.000，证明倒置显微镜观察分级结果与CCU测定值的幂指数(10的N次幂中的N)的绝对值显著相关，呈正比直线相关关系。从散点趋势图，也可看出散点存在显著的直线趋势。见图4。

图4 MP倒置显微镜下观察结果与FQ PCR值散点趋势图Fig.4 The Microscope Observation of Mycoplasma pneumoniae culture and the scatter plot of FQ PCR

2.4 MP稀释倍数与FQ PCR结果相关性分析

通过等级相关分析(Kendall法和Spearman法)，Kendall的tau_b相关系数为0.078，P值为0.614，Spearman的rho相关系数为0.074，P值为0.731，说明菌液的稀释倍数(10的N次幂)与FQ PCR值无相关。观察菌液稀释倍数与FQ PCR值曲线图，提示曲线并无显著规律，且每个样本的曲线不同；10-4稀释倍数时，4组FQ PCR值均较理想。见图5。

图5 各组MP稀释倍数与FQ PCR值曲线图Fig.5 The MP dilution factor and the FQ PCR value curve of each group

3 讨 论

由于支原体基因组小，生物合成能力有限，需由其寄生的宿主提供多种营养物质才能生长繁殖，培养基营养成分复杂。MP繁殖缓慢，1～6 h分裂一代，反复传代后生长加快。MP代谢产酸，酚红指示剂可以变色。CCU是培养基由红色变为黄色时的最高稀释度，则菌液浓度以CCU/mL计算。而MP测定CCU往往要经过10～14 d的培养，周期比较长。MP液体培养物在倒置显微镜下为球形或长丝状，以滑行方式运动[4]。实验室往往联合采用血清学、PCR或培养三种方法，以提高MP感染诊断的准确性[5]。由于MP培养困难，生长缓慢、分离率低，检测核酸和特异抗体是临床病原学检测的常用方法[6]。MP培养阳性率较低，临床诊断多用血清抗体滴度测定,而患者感染的病程、机体免疫状态及检测方法直接影响抗体检测的阳性率[7]。国内MP抗体检测灵敏度和特异度较差，致使临床对于MP感染检测能力有限[8]。而PCR扩增特异性基因片断检测，极大提高了MP诊断率,不同类型PCR检测MP核酸的研究在临床检测中已广泛应用。本研究采用实时荧光定量PCR技术，同时提取冻存不同时间的液体培养基中的MP菌液，使MP菌液模板处于同等的反应环境，避免了模板降解污染等情况发生。本研究采取了试剂公司上市的临床应用试剂盒，优化了实验反应条件，Taq酶等因素引起的扩增效率问题。实时荧光定量PCR技术拥有特异性强、灵敏度高、定量准确、全封闭反应等优点，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析[9-10]。该技术目前已成为分子生物学研究的重要工具，以其高灵敏度、高稳定性，已作为病原体检测的重要常用手段，将其作为MP病原体检测对比方法。

本研究将镜下观察MP的浓度和分布范围分为四级，即“++++”“+++”“++”“+”，测定CCU与FQ PCR，并与测定值进行关联，发现呈

正相关。镜下观察MP的分级越高，则测定的CCU与FQ PCR值就越高。因此在MP培养过程中，可通过MP镜下观察估算其CCU，较为简便实用。通过分析菌液稀释倍数与FQ PCR值曲线图，发现菌液稀释104倍数时，A、B、C、D四组FQ PCR测定值均较理想，可作为MP培养的最佳培养稀释倍数。本研究检测的时间点是培养10 d，若每天都能在倒置显微镜下观察MP生长情况，同时进行FQ PCR检测，将有利于更加准确、动态地对MP镜下观察等级与CCU测定值进行关联分析。

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