CARD-FISH技术及其在微生物生态学研究中的应用

路 璐

(西华师范大学 环境科学与工程学院，四川 南充 637009)

遗传和代谢多样性丰富的微生物在生物地球化学循环过程中起着主导作用，也是目前微生物生态学的重要研究对象。然而，绝大多数微生物种类尚不能通过传统的纯培养方法进行分离，目前估测的每升海洋水体和每吨土壤中分别含有2×106和4×106种微生物类群，而已分离出的纯菌仅约4 800种[1]。因此，人们对环境中微生物的种类及其生理代谢功能的认识还十分有限。为了尽量在原位环境下研究这些难培养微生物，在过去的几十年中，以非培养为基础的分子生物学技术手段，如聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)、变性梯度凝胶电泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE)、高通量测序技术等的迅速发展，已经能够在群落水平探知微生物的多样性及其生理代谢功能，同时也发现了在传统研究技术手段下以往无法发现的微生物种类及功能[2-6]，这些分子生物学技术已成为目前研究环境微生物的主要途径。然而，以DNA测序为基础的分析方法，仍存在很大缺陷。比如， PCR及全基因组扩增(whole gemome amplification, WGA)在扩增过程中，对不同丰度和种属的微生物存在一定的扩增偏差[7-8]，会导致所测结果与实际环境中相差甚远。同时，即使是具有相似 16S rRNA 基因组成的类群也不一定具有相同的代谢功能[9]，丰度较高的微生物也不一定发挥更重要的生态功能[10]。更重要的是，微生物发挥功能的基本载体是细胞，脱离了单个细胞，单纯的DNA/RNA和蛋白质仅仅是不同化学物质的简单堆积。因此，在细胞水平研究原位条件下微生物的系统发育水平及生理代谢是探究大多数难培养微生物生态功能的最好解决方法之一。荧光原位杂交 (fluorescenceinsituhybridization, FISH )是一项利用荧光标记的寡核苷酸或多核苷酸探针直接在染色体、细胞或组织水平定位靶序列的分子生态学技术，该技术结合了分子生物学的快速检测鉴定和显微技术的形态分析优势，能够对复杂的环境样品中难培养和未培养的微生物进行菌种鉴定、数量及细胞形态等进行分析。然而，FISH也存在着检测灵敏度低、探针杂交效率低等问题[11]，随着近年来对FISH技术的不断改进，这些问题也逐渐得到改善。其中催化报告沉积荧光原位杂交技术(Catalyzed reporter deposition-FISH，CARD-FISH) 或者酪胺信号扩增荧光原位杂交技术(Tyramide signal amplification-FISH，TSA-FISH)的检测灵敏度及检测效率要显著高于普通的FISH[12]。有研究表明CARD-FISH的检测灵敏度比普通的FISH要高出100倍，检测效率也高出1～3倍[13]，且这一技术已经在土壤、海洋和底泥等生境中微生物的研究中得到广泛应用[12-15]。随着各种分子生物学技术的发展，CARD-FISH与其他技术的联用，比如同位素示踪技术、纳米二次离子质谱技术(nano-meter secondary ion mass spectrometry， NanoSIMS)、扫描电镜及能量弥散X射线探测分析仪(secondary electron microscope/energy dispersive X-ray spectroscopy，SEM/EDX)等，使得在复杂环境样品中研究代谢活跃的微生物系统分类信息及原位代谢特征成为可能，这些技术联用方法在环境微生物生态学研究中起着越来越重要的作用。本文综述CARD-FISH技术的原理、要点及应用，并探讨该技术与相关技术相联用在环境微生物生态学中的应用和进展。

1 CARD-FISH技术的原理及要点

CARD-FISH技术的基本原理是在探针上连接辣根过氧化物酶(horse reddish peroxidase, HRP)，与样品细胞的rRNA或DNA完成杂交后，洗去游离的探针，加入荧光标记的酪胺(tyramide)进行荧光信号扩增，在HRP的催化作用下，有荧光基团标记的酪胺会大量沉淀在有探针结合的细胞内(图1)，起到放大荧光信号的作用，同时减少了背景干扰，增强了荧光的稳定性。另外，如图2中的荧光信号产生原理图所示，二阶TSA-FISH也是采用酪胺信号扩增方法来增加荧光信号，其进行了两步荧光信号扩增的过程[16]。由此看出，由于CARD-FISH和TSA-FISH在荧光信号产生原理的不同，使其二者比传统的FISH有更多的优势。CARD-FISH主要包括五个步骤：①菌体细胞固定及制备；②细胞通透性处理；③内源过氧化氢酶失活处理；④寡核苷酸探针杂交；⑤酪胺荧光信号扩增。完成以上步骤的载有细胞的玻片或滤膜在荧光显微镜下进行细胞荧光信号的检测。

图1 CARD-FISH的主要步骤Fig.1 Basic protocol for CARD-FISH

图2 FISH、CARD-FISH和二阶TSA-FISH原理示意图Fig.2 Schematic depiction of FISH, CARD-FISH, and two-pass TSA-FISH方框内的化学反应表示酪胺在细胞内的沉降过程[17]The scheme in the box depicts tyramide immobilization on tyrosine inside the cells[17]

1.1 菌体细胞固定及制备

细胞内含有的各种大分子化合物，如蛋白质、脂肪、碳水化合物、酶类等，支撑着细胞的形态结构并保证其新陈代谢过程。为防止在实验过程中细胞自溶或腐败，以及细胞内的酶对蛋白质的分解作用，同时保持原有的细胞形态，在进行FISH前都会对样品细胞进行化学固定。固定液一般选取蛋白变性剂，例如乙醇、甲醛、多聚甲醛等[18]。细胞固定液的浓度、固定时间和温度也是决定细胞固定效果的主要因素。如Pizzetti等研究发现，在对Planctomycetes采用2%的甲醛固定时，用FISH的检测效率却高于CARD-FISH所测得的检测效率；而用1%的多聚甲醛为固定液时，却得出相反的结论[19]。有些细菌在用乙醇固定后会导致荧光信号的减弱[20]。所以，在对特定微生物应比较分析不同固定液和固定条件对检测率和细胞形态的影响，并选择合适的细胞固定方法，可以显著提高数据的可信度。

1.2 细胞通透性处理

由于普通FISH的荧光标记物的分子量大约在500～1 000 Da，可以轻易地透过细胞膜进入胞内和靶序列结合，而CARD-FISH使用的探针连接的HRP大约在5～6 nm，分子量高达40 kDa，极大地限制了探针进入细胞内，从而影响杂交效率。虽然有些细菌仍然可以采用CARD-FISH 被检测到，如海洋底泥中的浮霉菌[21]和具有S层结构的产甲烷菌[20]，但大多数原核细胞需要在探针杂交前进行细胞通透性处理。鉴于不同细菌和古菌的细胞膜结构千差万别，细胞的通透性处理没有标准方法。

细胞通透性处理主要分以下三种：①酶处理：常用于细胞通透性处理的酶主要有溶菌酶、消化肽酶、蛋白酶K和假肽聚糖肽链内切酶。其中溶菌酶通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁的不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽从而增加细胞通透，尤其对处理革兰阴性的微生物时效果最佳[22-23]。在对革兰阳性的微生物进行细胞膜通透性处理时，研究发现单纯的溶菌酶处理不能完全将其通透化处理[24]。Sekar等[25]发现在使用溶菌酶处理革兰阳性的微生物后，继续采用消化肽酶再一次进行细胞通透性处理可以使其达到较好的效果。此方法在古菌和浮霉菌细胞通透性处理中较为常用[26-27]。蛋白酶K由于在处理细胞时，其浓度及处理时间的不同常会导致差异显著的结果[22,28]，但蛋白酶K能有效对古菌细胞进行通透性处理[20,29]。假肽聚糖肽链内切酶常用于处理含有假肽聚糖的产甲烷菌[30]。②化学处理：在探针杂交缓冲液中常加入十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate, SDS)以增加探针与rRNA的结合效率[31]，也有研究在溶解酶处理细胞通透性后，再用SDS或者SDS/二硫苏糖醇处理[32]。另外，HCl处理海洋古菌细胞，也可以增加细胞的通透性[29]。③微波处理：在不能确定细胞结构及其有效地通透处理剂时，可采用微波处理的方法。采用此方法进行细胞通透性处理成功地在海洋底泥中检测到ANME-2c-group的厌氧甲烷氧化菌[33]。Tischer等[34]对Tris-EDTA溶液中的细胞进行微波处理，最终也能检测到细菌和古菌。

1.3 内源过氧化氢酶失活处理

在CARD-FISH中的荧光扩增过程中，其起始步骤是在探针上的辣根过氧化氢酶HRP的催化作用下将过氧化氢转化为羟基自由基，因此在开始CARD-FISH之前，必须对细胞内的过氧化氢酶进行失活处理，以避免假阳性荧光信号产生。然而，目前此处理并没有标准方法，针对不同环境的样品需要优化方案来进行过氧化氢酶失活。有研究表明，采用含有0.15% H2O2的乙醇溶液可以有效地将胞内的过氧化氢酶失活，而高浓度的H2O2(>3%) 将造成DAPI染色的细胞数量显著减少[27]。但对于细胞内含有高浓度过氧化氢酶的微生物，如海水中的厌氧氨氧化微生物可采用浓度为3% 的H2O2处理[35]。另外，采用0.01 mol/L的HCl溶液或0.1%的焦碳酸二乙酯溶液也常用于抑制细胞内过氧化氢酶的活性[12,35]。

1.4 寡核苷酸探针杂交

在环境微生物学中，荧光原位杂交最常用的靶序列是具有遗传稳定性的16S rRNA，根据已有的数据库序列，设计出针对不同种属的探针，如表1中列出常用的特异寡核苷酸探针。为了更有效地提升探针的结合率和精准性，也有研究使用肽核酸(peptide nucleic acids，PNA)和锁核酸(locked nucleic acids，LNAs)作为探针进行杂交，这两种探针与互补序列具有比寡核苷酸探针更强的亲和力[36]，在检测细菌细胞的rRNA时具有较高的灵敏性，但由于其合成费用较高限制了其在微生物研究中的应用。另外，多核苷酸探针在研究中也有使用，但其特异性较低，无法精确到种属水平，主要初步鉴定微生物的分类级别[37]。

表1 环境微生物 FISH中应用的特异寡核苷酸探针

注：†表示EUB338、EUB338-II和EUB338-III三种探针按等浓度混合(EUBMIX)用于检测总细菌；表示在探针杂交过程中，需要同时加入竞争探针

在探针与目标微生物杂交过程中，有研究者为了防止连在探针上的HRP酶失活，将杂交温度降到35 ℃或40 ℃[16,38]。然而，最近也有研究者证明在高至55 ℃的杂交温度条件下2 h，仍能保证HRP的活性[27]。所以，46 ℃的标准杂交温度在实际实验中较为常用。在CARD-FISH实验中，为了减少背景荧光的影响，探针的浓度要求比普通FISH的浓度要低一些，一般浓度在0.1～0.5 μmol/L之间。同时，在杂交缓冲液中常加入阻断剂来减少非特异性荧光信号的产生[25]。另外，杂交缓冲液中甲酰胺的浓度也需要在参考普通FISH浓度的基础上，根据特定探针进行优化调整。这是由于连有HRP的探针和连有荧光素的探针的解离属性有所差异[39]。

图3 水体底泥中总细菌的FISH (A)和CARD-FISH(B)Fig.3 Detection of marine sediment bacteria by FISH(A) and CARD-FISH(B)FISH采用Cy3(A)标记的探针EUB338，CARD-FISH采用HRP标记的探针EUB338，并用Oregon Green 488(B)标记的酪胺进行荧光扩增过程；FISH所得图片的曝光时间为1.0 s，CARD-FISH为0.2 s(未发表)FISH with Cy3-labeled (A) probe EUB338,CARD-FISH with HRP-labeled EUB338 probe and Oregon Green 488-labeled (B) tyramide; Exposure times were 1.0 s for FISH and 0.2 s for CARD-FISH(unpublished data)

1.5 酪胺荧光信号扩增

荧光信号的扩增过程是多个连有荧光素的酪胺分子在辣根过氧化氢酶的催化作用下，形成沉淀物在细胞内不断累积的过程。如图3所示，针对同一样品，CARD-FISH的荧光信号要显著高于FISH，且CARD-FISH荧光信号有较高的稳定性，能显著提高目标微生物的检测率，保证了细胞计数及后续实验的可操作性。在实验中常在扩增缓冲液中加入10%～30%的硫酸葡聚糖和不同浓度的无机盐[16,46]。酪胺浓度也是影响扩增效率的重要因素，一般随着浓度的升高，细胞荧光值也会越高。然而，也有研究发现过高的酪胺浓度会导致较高的荧光背景值从而干扰目标微生物的检测率[12]。

2 CARD-FISH技术的应用

近年来，随着CARD-FISH技术的迅速发展和优化，适用于不同样品和研究目的的方法逐渐成熟，如mRNA-FISH、gene-FISH等技术可以鉴定环境样品中微生物的系统分类及生理功能信息等。此外，CARD-FISH技术与其他技术联合使用可以获得微生物的更多信息，如CARD-FISH与同位素示踪技术、NanoSIMS、SEM/EDX等的结合，成为耦合研究复杂环境中微生物物种组成及其生理功能的有力工具。

2.1 研究环境微生物的群落结构与功能

在复杂环境中同时获得微生物的系统分类信息及其代谢功能是微生物学研究的难点和热点。以rRNA为靶序列，仅能获得其系统发育信息，但不能揭示其原位环境的代谢功能。mRNA-FISH是探究微生物原位生理代谢的解决办法之一，然而mRNA在细胞内非常不稳定且数量较少。1998年Wagner等[47]首次以iap(invasion-associated protein)-mRNA为靶序列成功地采用CARD-FISH标记到含有目标基因的微生物细胞。 2002年Bakermans等[48]采用FISH和TSA的方法在被污染的地下水中检测到转录萘双加氧酶的mRNA。这些研究中都提出，在杂交前对细胞用脱氧核糖核酸酶(Deoxyribonuclease, DNase)处理，以去除DNA的干扰，同时在荧光显微镜观察时加大曝光时间(>10 s)来获得更清晰的荧光信号，都能有效地提高mRNA的检出效率。另外，有两次荧光扩增过程的TSA-FISH也能提高检测mRNA的灵敏度[16]。Pernthaler等[49]将rRNA和mRNA同时作为靶序列进行FISH，研究了甲烷氧化菌中编码甲烷单氧化酶A亚基pmoA在环境中的表达，这是首次采用rRNA-FISH和mRNA-FISH相结合的方法将微生物的系统发育信息和功能活性联系起来。依据该方法，Pratscher等[50]对土壤中的氨氧化古菌进行研究，采用CARD-FISH将土壤中氨氧化古菌的16S rRNA及编码其氨单氧化酶A亚基amoA基因的mRNA同时进行定量，直接反映了原位环境中氨氧化古菌的功能活性。最近，mRNA-FISH和荧光激活细胞分选技术相结合也成为研究原位环境微生物生理生态的主要方法之一，Cesar等采用CARD-FISH检测污泥中亚硝酸盐还原菌中编码亚硝酸盐还原酶nirS的mRNA基因，随后采用流式细胞仪分选出被荧光标记的细胞，进一步对这些细胞采用变性梯度凝胶电泳技术(DGGE)和测序技术明确了目标微生物分类信息[51]，该方法对探究未知种属微生物的功能及其活性具有重要参考价值。

近些年，在染色体或者微生物DNA上检测基因序列逐渐发展起来，这类荧光原位杂交称为Gene-FISH[52-54]。DNA相较于RNA有更好的稳定性，且在DNA上检测基因序列对推测微生物的潜在功能有重要意义，但是其拷贝数通常非常低。Kawakami等[52]首次采用两步TSA-FISH扩增荧光信号，成功标记到产甲烷菌的甲基辅酶还原酶 (Methyl coenzyme M reductase,mcrA)基因，其采用的锁核酸探针也同时提高了杂交的效率和特异性，但该方法的检测效率仍然仅在15%。随后，采用两步TSA-FISH结合双链DNA多核苷酸探针进行步骤优化，将检测效率显著提高到约98%[53]，该研究在底泥中检测到腺苷-5′-磷酸硫酸激酶α亚基基因和mcrA基因。此外，Moraru等[54]首次采用CARD-FISH在海水中同时检测到氨氧化古菌的16S rRNA基因和amoA基因，该研究的检测效率大约为40%。为提高此技术的检测效率，Petersen等[57]提出采用四个双链DNA多核苷酸探针对目标基因的不同位置进行同时杂交，有效提高了Gene-FISH的灵敏度。总之，以rRNA和DNA为基础的CARD-FISH的发展为原位研究复杂环境微生物群落的结构和功能提供了很好的技术支撑。

2.2 以CARD-FISH为基础的仪器联用

2.2.1 CARD-FISH与NanoSIMS联用在微生物生态上的应用 不同的科研仪器在分析对象、精确度、样品要求等方面各有差异，在微生物研究中常常需要同时获得微生物的形态结构、发育信息及生理功能等信息，这就要求不同的科研仪器联用来达到研究目的。如图4所示，CARD-FISH与不同的技术联用，使得耦合分析微生物的多种生物学信息，极大地扩展了其在微生物研究中的应用价值。目前，CARD-FISH技术与NanoSIMS的联合使用在微生物学研究中已有较为成熟的应用。 两者的首次联用是在2001年Orphan等利用FISH与SIMS结合的方法，证实了海洋沉积物中存在的厌氧甲烷氧化古菌能够代谢13C-CH4[58]，该技术联用能同时获得微生物单细胞水平的分类信息和代谢功能。但NanoSIMS只能对样品的同位素进行分析，无法获得其荧光信息，且NanoSIMS的测定精度在纳米到微米级别，在数以万计的细胞中找到目标微生物成为难题。为解决这一问题，有研究采用激光显微切割仪(Laser microdissection microscope，LMD), 将其激发光调至CARD-FISH的荧光激发波长，找到目标微生物对其周围进行激光标记[59-60]，该标记使得在NanoSIMS仪器上通过识别标记的区域，快速精准地找到目标微生物进行测定。如Milucka等[61]采用此方法针对湖泊水体中活性甲烷氧化微生物进行研究，水体首先进行13C-CH4的同位素标记短期培养，通过CARD-FISH分别识别培养的水体中的隶属于变形菌Gammaproteobacteria和Alphaproteobacteria种属的甲烷氧化细菌，并对这些细胞周围进行LMD标记，随后NanoSIMS对目标微生物进行13C的分布及含量测定，结果表明Gamma种属的甲烷氧化菌主导了所研究水体的隶属于变形菌甲烷氧化过程。 此外，CARD-FISH/FISH结合NanoSIMS也应用于研究参与氮、硫等生物地球化学循环的微生物。如Fike等[62]采用此方法首次在单细胞水平，通过测定34S的丰度研究了高盐环境下微生物垫中的活性硫酸盐还原菌群，揭示了硫酸盐还原菌与硫化物空间分布的关系以及菌群内部的代谢异质性。Halm等[63]运用此技术联用方法，针对复杂的水体环境样品鉴定出厌氧层中发挥固氮作用的微生物主要是占总微生物数量比例很小的绿硫细菌Chlorobiumtepidum/Cphaeobacteroidesy。Dekas等[64-65]采用此方法,发现甲烷厌氧古菌ANME-2和细菌Desulfosarcina/Desulfococcus(DSS)的聚合体间存在元素迁移，ANME-2将固定的N元素转运给DSS细菌。最近，Musat等[66]对CARD-FISH对后续同位素测定的影响进行了评估，研究表明CARD-FISH实验过程对细胞不同元素的同位素含量的影响有差异，且所测同位素误差与细胞所在的生长发育阶段有关。

图4 荧光原位杂交技术与相关技术联合使用应用于环境微生物的技术路线图Fig.4 Diagram of the major steps in combining using FISH with other techniques in environmental microbiology studies

近几年发展起来的卤素原位杂交(Halogeninsituhybridization，HISH)与NanoSIMS联用也常用于研究微生物单细胞水平的生理生态功能。HISH-FISH是采用HRP标记的探针和连有卤素元素(如氟、氯)的酪胺进行杂交和荧光扩增，在目标微生物中沉积了大量卤素元素，这样使得NanoSIMS可以通过测定卤素元素的分布从而确定目标微生物的位置[59]。Musat等[59]采用此技术对湖泊水体中三种厌氧光合细菌Chromatiumokenii、Lamprocystispurpurea和Chlorobiumclathratiforme的碳氮利用效率进行了研究，向水体中加入13CO2和15NH4+作为以上三种细菌的碳源和氮源，结果发现同种菌群不同细胞的碳氮代谢速率有很大差异，不同菌群间的差异显著。NanoSIMS同位素测定结合CARD-FISH计数统计结果表明细胞总量仅占总微生物群落0.03% 的C.okenii，却同化了70%的总碳和40%的总氮，研究指出代谢活性最强的微生物不一定在数量上占优势[59]。综上所述，以上这些CARD-FISH与NanoSIMS的联用为在单细胞水平，探索参与元素生物地球化学循环的微生物生态功能提供了强有力的研究方法。

2.2.2 CARD-FISH与其他仪器的联用 CARD-FISH与其他光学、电子学仪器，如显微放射自显影术(microauutoradiography, MAR)、SEM/EDX、流式细胞仪等仪器的联用也成功应用于微生物的研究中(图4)。CARD-FISH-MAR的技术路线是首先采用放射性同位素标记的底物培养微生物底物，在对细胞进行荧光原位杂交后，通过微量自动照相集成技术对微生物进行分类鉴定和底物代谢特性研究[68-69]。例如Teira等[70]采用CARD-FISH-MAR用3H-天冬氨酸对深海水体进行短期培养，研究发现深海古菌数量远高于细菌数量，且古菌代谢天冬氨酸的速率比细菌高。Schmidt等[71]联用CARD-FISH和SEM-EDX等技术，使得在鉴定微生物分类水平的同时，也获得更高分辨率的细胞形态信息，该方法被称为“Gold-FISH”，其原理是通过在酪胺上同时结合了荧光素、纳米金粒子和链酶亲和素，经过荧光扩增后，目标细胞内沉积了大量荧光素的同时，也有纳米金粒子的沉积，这使得不仅可以在荧光显微镜下检测目标微生物的数量，且可以通过SEM-EDX检测金元素的分布而获得目标微生物的高分辨率形态结构。流式细胞仪是对微生物细胞进行计数的常用方法之一，CARD-FISH与流式细胞仪的结合可以针对复杂环境样品进行特定微生物的计数和分离。该联用方法要求CARD-FISH的全部过程在悬浮液中进行，每一步完成后通过离心收集细胞，然后使用荧光激活流式细胞仪对有荧光的目标微生物进行计数[72]。此外，Sekar等[73]采用此方法对海洋水体中细菌进行分离，并对流式细胞仪分离出的细胞进行16S rRNA测序获知细菌群落组成信息，这一方法为研究水体环境中微生物多样性和单细胞基因组学为基础的生理代谢分析提供新的思路。此外，Huang等首次结合FISH和拉曼(Raman)光谱仪研究了细菌Pseudomonas单细胞水平降解13C-萘的活性[74]，也为CARD-FISH与拉曼光谱仪的联用提供坚实的技术基础。

3 小 结

CARD-FISH技术的发展显著地提高了其在环境微生物研究中的科学研究价值和应用开发意义，并且已经在单细胞水平研究环境微生物的原位生理生态功能方面显示出很大的优势和重要的应用前景。CARD-FISH克服了FISH的荧光不稳定性、信号弱等内在技术瓶颈，极大地促进了FISH技术在探究环境中丰度较低或极低微生物的应用。同时，CARD-FISH的高度灵敏性使其不仅能够针对微生物细胞的16S rRNA进行系统发育信息鉴定，更能对mRNA和DNA上的功能基因进行检测，来探究环境样品中代谢活跃的微生物生理过程和潜在生态功能[17]。随着各种光学、电子学等仪器在微生物学领域的广泛应用，如本文重点讨论的NanoSIMS、SEM/EDX、流式细胞仪等，CARD-FISH与这些技术的联用将为环境微生物学研究提供更多关于微生物类群和功能的信息，解决单一研究方法无法确定并准确回答的科学难题。尤其是CARD-FISH、同位素示踪技术与NanoSIMS的联用突破了以往在群落水平研究环境微生物的生理代谢功能，进一步精准地在单细胞水平识别不同微生物在物质代谢中的活性和贡献率，对定向发掘自然环境中的微生物资源有重要意义[75]。未来开发CARD-FISH与相关微生物技术的联用，应用于研究参与生物地球化学循环的关键功能微生物、微生物物质代谢机制、筛选高效污染物降解菌等方面，将具有良好的发展前景。

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