海洋季也蒙毕赤酵母ACP基因的克隆及生物信息学分析

陶永佳， 李 根， 薛永常

(大连工业大学 生物工程学院，辽宁 大连 116034)

脂肪酸代谢途径是生物体内主要的代谢途径[1]，其产物主要被利用作为细胞膜的合成，而一些产物用作群体感应和蛋白转录后修饰[2]。酰基载体蛋白(Acyl carrier protein，ACP)作为脂肪酸合酶(Fatty acid synthases，FAS)的中心组件，能够结合脂肪酸代谢途径中各种脂肪酰基中间体，是不可或缺的辅因子[3-6]。ACP是一个小的、含量丰富、高度保守的载体蛋白，其三级结构由三个平行的α螺旋和一个短的横向的α螺旋组成[7-8]，这四个α螺旋束形成一个疏水性的腔，并具有高度的结构适应性，能够容纳不同长度的酰基链，结合酰基中间体，在各种酶的活性位点之间传递[9-11]。ACP结构和功能已经引起广泛的关注，近几年，主要对其三级结构以及功能多样性分析。本实验室前期从海洋浅海淤泥及岩石附着藻类上筛选得到1株高产油脂菌，经鉴定为海洋季也蒙毕赤酵母，本研究通过对该酵母的ACP基因的克隆，利用生物信息学网站和软件对其拟表达蛋白的理化性质、结构进行预测分析，对酰基载体蛋白的功能深入研究具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种来源 海洋季也蒙毕赤酵母(Meyerozymaguilliermondii)T-1，本实验室筛选保藏；大肠埃希菌E.coliDH5α，本实验室保藏。

1.1.2 培养基 酵母为YPD培养基，陈海水配置；大肠埃希菌为LB培养基。

1.1.3 试剂盒 Ezup柱式酵母基因组DNA抽提试剂盒，UNIQ-10 柱式微量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，生工生物工程(上海)股份有限公司；T-Vector pMDTM19试剂盒，宝生物工程(大连)有限公司；质粒小提试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计 以NCBI数据库中MeyerozymaguilliermondiiATCC6260的酰基载体蛋白基因序列(CH408159.1:383672-384055)为模板，利用Primer 5.0软件设计引物：上游引物序列5′- ATGTTGAGAACCGCCCTT- 3′；下游引物序列 5′-TTAACAAGCATCGGGCTG -3′。交由北京六合华大基因科技有限公司合成。

1.2.2 mgACP基因的克隆 按照Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒(酵母)说明书提取海洋季也蒙毕赤酵母T-1基因组DNA，以此DNA为模板，利用上述合成的特异性引物扩增mgACP基因。PCR扩增体系：DNA模板1 μL，10×PCR buffer 2 μL，dNTP 1 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，TaqDNA Polymeras(2.5 U/μL) 0.5 μL，ddH2O补齐至20 μL。PCR扩增反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。

1.2.3 重组质粒构建及鉴定 采用UNIQ-10柱式微量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收1.2.2的PCR扩增产物，将回收产物与载体pMD19-T连接，转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞。经蓝白斑筛选阳性克隆菌落，进行菌落PCR，通过质粒小提试剂盒提取重组质粒并用Hind Ⅲ、SacⅠ进行双酶切验证，阳性单克隆交由北京六合华大基因科技有限公司测序。

1.2.4 mgACP基因的生物信息学分析 将目的基因序列测序结果，提交到NCBI数据库中ORF Finder[12]查找mgACP基因的开放阅读框，并对获得的氨基酸序列进行同源序列比对，利用ExPASy网站在线工具[13]进行蛋白生理生化特性、疏水性/亲水性、信号肽、跨膜结构域、磷酸化位点预测和分析；Npsa SOPMA和SWISS-MODEL分别对蛋白二级结构和三级结构预测分析[14]。用Clustal X2进行多序列比对，通过MEGA 6.0构建系统发育树[15]。

2 结果与分析

2.1 mgACP基因的克隆

2.1.1 mgACP基因的扩增结果 以海洋季也蒙毕赤酵母T-1 基因组DNA为模板，用1.2.1合成引物扩增mgACP基因，扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，结果见图1。

由图1可知，在380 bp左右有1条清晰的条带，无杂带，与预期的大小一致，可以进行后续实验。

图1 mgACP基因的扩增电泳图Fig.1 Agarose gel electrophoretic analysis of amplificationmg ACP geneM：Trans2K DNA Marker；1：mgACP基因M：Trans2K DNA Marker；1：The gene of mgACP

2.1.2 菌落PCR鉴定结果 用牙签挑取阳性单克隆菌落，按1.2.2所述的PCR反应体系和扩增条件进行菌落PCR，产物经2%琼脂糖凝胶电泳，结果见图2。

由图2可知，挑取阳性单克隆菌落经菌落PCR得到的目的基因条带在380 bp左右有1条清晰的条带，与预期大小一致，可以进行后续实验。

图2 菌落PCR凝胶电泳图Fig.2 Agarose gel electrophoretic analysis of colony PCRM：Trans2K DNA Marker；1：阳性单克隆菌落M：Trans2K DNA Marker；1：Monoclonal colony of positive

2.1.3 酶切验证结果 提取重组质粒，用HindⅢ/SacⅠ对重组质粒进行双酶切验证，产物经1%琼脂糖凝胶电泳，结果见图3。

图3 质粒双酶切电泳图Fig.3 Agarose gel electrophoretic analysis of colony PCRM：D 2000 Marker；1：重组质粒双酶切；M：D 2000 Marker；1：Recombinant plasmid by double restrictionenzyme digestion

由图3可知，阳性单克隆菌落的重组质粒经HindⅢ/SacⅠ进行双酶切，在2 500 bp和450 bp左右各有1条清晰的条带，与预期结果一致，说明目的基因与载体正确连接，可以进行测序。

2.2 生物信息学分析

2.2.1 测序结果分析 测序结果显示，在载体上反向插入384个碱基，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA，利用NCBI中的ORF Finder程序查找开放阅读框。结果显示，mgACP序列具有完整的开放阅读框，编码127氨基酸，含有磷酸泛酰巯基乙胺结合位点，说明该序列为酰基载体蛋白基因。

2.2.2 蛋白质理化性质分析 利用ExPASy ProtParam在线分析mgACP蛋白的理化性质。预测结果显示mgACP蛋白的分子式为C619H998N162O195S1，分子量为13.862 kDa，等电点为4.74，其N端为亮氨酸 (Leu)，带负电的氨基酸残基(天冬氨酸和谷氨酸)共20，带正电的氨基酸残基(精氨酸和赖氨酸)共13，拟表达蛋白为不稳定性蛋白。GRAVY值为 -0.050，表明mgACP蛋白拟表达蛋白为亲水性蛋白。

2.2.3 蛋白质疏水性/亲水性预测和分析 利用ExPASy ProtScale在线分析mgACP蛋白质的疏水性/亲水性，结果见图4。

图4 mgACP亲水性分析Fig.4 Hydropathy plot of the amino acid sequence of mgACP

氨基酸分值越低亲水性越强，分值越高疏水性越强，图4显示MIN:-1.878，MAX: 1.622，整个多肽链呈亲水性，因此mgACP蛋白质为亲水性蛋白，与蛋白质理化性质分析结果一致。

2.2.4 蛋白质信号肽预测分析 利用SignalP 4.1 Server的神经网络算法对mgACP蛋白信号肽预测和分析，结果见图5。结果显示，mgACP蛋白质不存在信号肽，因此属于非分泌型蛋白。

图5 mgACP信号肽预测Fig.5 Signal peptide prediction of mgACP

2.2.5 蛋白质跨膜结构域预测与分析 利用TMHMM server v.2.0对mgACP蛋白跨膜结构域预测和分析，结果见图6。结果显示ACP无跨膜结构域，与信号肽分析结果一致。

图6 mgACP跨膜结构域预测Fig.6 Transmembrance domin prediction of mgACP

2.2.6 蛋白质磷酸化位点预测和分析 利用netphos 2.0 server对mgACP蛋白质潜在的磷酸化位点预测和分析，结果见图7。

图7 mgACP磷酸化位点预测Fig.7 Phosphorylation site prediction of mgACP

蛋白质的磷酸化与蛋白的功能密切相关，潜在磷酸化位点越多，可能发挥更多的功能。从图中可以看出，mgACP蛋白质潜在磷酸化位点有9个。

2.2.7 蛋白质二级结构预测和分析 用Npsa SOPMA预测mgACP的蛋白二级结构。结果见表1。该蛋白主要以α螺旋和无规则卷曲为主，其中α螺旋占47.24%，延伸链占15.75%，无规则卷曲32.28%。无规则卷曲结构较多，说明该蛋白并不稳定。

2.2.8 蛋白质三级结构预测和分析 利用SWISS-MODEL采用同源建模法，对mgACP蛋白质的三级结构进行预测分析，结果见图8。从图8中可看出，mgACP主要以α螺旋、延伸链和无规则卷曲组成，有4个α螺旋，与二级结构预测结构基本一致，与已报道的酰基载体蛋白结构具有高度相似性。

表1 mgACP二级结构预测

图8 mgACP的三级结构预测Fig.8 Prediction 3D Structure of mgACP

2.2.9 系统发育树分析 将mgACP蛋白序列提交到NCBI数据库进行BLAST比对，与MeyerozymaguilliermondiiATCC 6260酰基载体蛋白序列(EDK40062.2)相似度为99%。选取7株与目的菌株具有较高的同源性序列进行多序列比对(图9)，发现酰基载体蛋白较为保守，并进一步用邻接法构建系统发育树分析，结果见图10。

系统进化树分析表明，mgACP与季也蒙毕赤酵母(Meyerozymaguilliermondii)ATCC6260属于同一分支，亲缘关系最近，与BLAST的结果一致。

图9 Meyerozyma guilliermondii T-1与其他酵母ACP同源氨基酸序列的多重比对Fig.9 Sequence alignment ACP from Meyerozyma guilliermondii T-1 and other homologous yeast

图10 mgACP系统发育树Fig.10 The Phylogenetic tree of mgACP

3 讨 论

本研究从海洋季也蒙毕赤酵母T-1的基因组中扩增获得384 bp的酰基载体蛋白基因序列，其编码127氨基酸，具有酰基载体蛋白家族保守区域磷酸泛酰巯基乙胺的结合位点，说明其为酰基载体蛋白基因。生物信息学进一步分析显示，该基因拟表达蛋白为不稳定的非分泌型的亲水性蛋白质，不存在信号肽和跨膜结构域，存在9个潜在的磷酸化位点，与酰基载体蛋白结构的高度适应性相符；其二级结构和三级结构显示主要以α螺旋和无规则卷曲结构为主，与已报道的酰基载体蛋白结构[7-8]具有高度相似性，为以后深入开展酰基载体蛋白的功能研究提供参考。

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