鹿红方对心力衰竭大鼠过氧化物酶增殖物激活受体和心肌组织的影响

戎靖枫，封 舟，刘 茜，周耀中，王 咏，方宏钧，周 华

·基础医学论著/研究·

鹿红方对心力衰竭大鼠过氧化物酶增殖物激活受体和心肌组织的影响

戎靖枫，封 舟，刘 茜，周耀中，王 咏，方宏钧，周 华

目的 观察鹿红方对心力衰竭大鼠过氧化物酶增殖物激活受体(PPAR)和心肌组织的影响。方法 分离鹿红方全方水煎液，用蒸馏水、30%乙醇、60%乙醇和95%乙醇洗脱，得到4种提取液，分别成为A、B、C、D液，分组为A组、B组、AB组、C组、AC组、BC组、ABC组、D组、AD组、BD组、ABD组、CD组、ACD组、BCD组，共14组，第15组曲美他嗪，第16 组假手术组。分别给96只通过冠脉结扎法制备充血性心力衰竭成功的大鼠模型灌胃。应用Western Blot检测 (WB) 测定不同剂量的鹿红方对心肌细胞PPARα蛋白表达的影响，对心肌组织进行HE 、VG染色，观察心肌细胞病理形态结构。结果 鹿红方具有明显上调PPARa的作用，可以让无序的心肌纤维定向排列，使心衰心脏的心功能得以改善，对心衰病理改变有显著降胶原纤维的作用，有显著降低 PVCA的功效。结论 不同剂型鹿红方药物血清组都可通过上调PPARα的表达，发挥其改善心肌组织功能作用，表明鹿红方是中医药治疗心力衰竭的良好药物。

心力衰竭；鹿红方；过氧化物酶增殖物激活受体；心肌组织；心悸

心力衰竭是当今临床实践中各种病因导致人类心脏功能下降的一种复杂综合征，也是各种心脏疾病的严重和终末阶段。近年来，国民心脏疾病的发病率、死亡率上升势头明显，现已成为世界范围内危害公众健康的疾病之一[1]。心衰不仅对国民健康产生不良影响，也给社会公共卫生事业的健康发展带来了挑战。

据不完全统计，2014年全球心力衰竭病人数量已高达1.2亿，我国现有此类病病人2 997.1万，已超过全世界总量的四分之一，有可能成为全球拥有心力衰竭病人人群最多的国家。另有研究表明[2]，我国心力衰竭病人平均发病年龄为66周岁，比欧美、日本等发达国家提早至少4岁，主要是因为我国现有医疗技术还很难控制好心衰危险的核心要素，如果不及时进行诊断治疗，影响心衰病人的药物应用依从性效果。

心衰与心肌能量代谢密切相关，心衰的基本病因是原发性心肌损害(包括代谢障碍)或心脏负荷过重。如果心衰是由于心肌组织损伤引起，其症状体征首先表现为瘀血证；由于舒张功能作用减退和心肌无力收缩等原因导致血液不能回流，从病机转化角度可推测，由于“瘀血”可引起心脉受阻，这会造成体内线粒体ATP锐减，根本原因是心肌组织细胞缺血缺氧而导致[3]，这也会产生心脏收缩跳动无力的气虚，气虚时心脏不能有效地推动血液流动，必然会引起血瘀或进一步加重血瘀。据研究，过氧化物酶增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)是心肌代谢脂肪酸氧化酶基因主要的转录调节因子[4]，不仅在正常的心肌代谢稳态中起关键作用，而且它的信号改变和很多种疾病状态的发病机制有关，因此，以PPAR作为阻止病理性心脏重构的治疗策略为目的[5]。上海中医药大学附属曙光医院专门研制了临床特效经验方鹿红方，它具有温肾促阳、活血通络和益气强身的三种功效，特别是对心肌功能的恢复改善具有很好的促进作用，为有效缓解心力衰竭症状、延缓心力衰竭进程等[6]。本研究通过实验数据来验证鹿红方对心力衰竭小鼠PPAR和心肌组织的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物 雄性成年健康SD系，200 g±30 g，供货方为上海中医药大学动物实验中心。动物合格证号：SCXK( 沪) 2015-0016。

1.1.2 药物 鹿红方组成：鹿角、红花、黄芪、桂枝、葶苈子、党参。由深圳华润制剂有限公司制作并提供中药颗粒剂。

1.1.3 试剂和仪器 水平凝胶电泳系统Horizontal Gel、PCR仪Applied Biosystems ProFlexTM、一体化蛋白免疫印迹GE AWB、WB加速器SNAP i.d.。即时细胞分析仪ChemoNC-3000、倒置显微镜ECLIPSETS100、石蜡切片机Leica、相差显微镜DPH-200、ECLIPSE Ti

1.2 动物模型制备与分组 体内实验：大鼠心肌梗死造模方法参照Johns 和Olson 的方法并加以改进[7]。用乙醚对实验大鼠进行麻醉，对其皮肤进行消毒，术前心电图也要做好记录。在左侧胸部心脏搏动最强处的上一肋间，刀切1.5 cm口，钝性分离至胸壁。用剪刀捅胸腔，在上一肋骨与胸骨交界处剪断，将心脏向左侧破口处推挤，剪破心包膜后让心脏复位，大鼠呼吸恢复正常后，将其心脏从胸腔中推挤出，左冠状动脉前降支结扎必须在距动脉根部2 mm 处进行。将心脏推回进胸腔，并对开口的皮肤进行缝合，动物稳定后记录标准

Ⅱ导联心电图( 纸速50/s)，ST段弓背抬高示心肌梗死形成，表明顺利完成结扎。术后给予青霉素4×104U，皮下注射，连续3 d。造模成功后共96 只大鼠，据计算机编制的随机分配表及正交设计方法随机分为16 组，每组6只。灌胃需要用5 mL/d的药液进行，空白组为第16组。术后给予青霉素4×104U，皮下注射，连续3 d。体外实验：H9c2(2-1)大鼠的心肌细胞[8]，中国科学院细胞库专门提供。

1.3 药物干预方法 HP20型大孔吸附树脂分离鹿红方全方水煎液(浓度为2 g生药/mL)，分别用95%乙醇洗脱、60%乙醇、30%乙醇和蒸馏水调配形成4 种提取液，分别简称为A：蒸洗液、B：30%液、C：60%液、D：95%液。挥尽回收乙醇后，以蒸馏水转溶，调整体积(按比例折合含全方生药12.5 g/mL)，罐封冷藏备用。各组药液中适当增添生理盐水，并调配形成浓度为2 g生药/mL的药液。术后2周开始，分别以A、B、AB、C、AC、BC、ABC、D、AD、BD、ABD、CD、ACD、BCD给14组灌胃给药，连续8 周。第15组曲美他嗪10 mg/(kg·d)连续8 周。假手术组是第16 组，每天用生理盐水5 mL/d 进行专门灌胃，时间确定为连续8 周。

1.4 检测指标与方法

1.4.1 WB检测 从组织中抽提蛋白，蛋白跑电泳，孵育目的体，显色曝光。

1.4.2 病理分析 HE、VG染色：大鼠左室心肌标本用10% 甲醛溶液进行固定，并通过常规石蜡予以包埋，制备约0.4 μm 厚的连续石蜡切片，分别行快速VG染色、HE并观察。计算胶原容积指数(ICVF)、血管周围胶原面积/管腔面积比值(PVCA)。

2 结 果

2.1 WB检测PPARα的相对表达量 第16组假手术组几乎不表达PPARα，第5组的PPARα相对表达量0.32(见表1)，相对于第16组，PPARα的相对表达量(P< 0.05)，仅显示有效，西药组是第15组，该组表达量为21.87，效果最好。14组、12组、11组、10组、8组疗效皆显著，但总体疗效都低于西药组，且依次递减。其余各组相比于疗效显著。

表1 WB检测PPARα的相对表达量(±s)

2.2 Western blot实验结果 (见图1) 与假手术组相比，中药组PPARa表达都有所增加，提示鹿红方各剂型都可以提高PPARα的表达。H9C2大鼠心肌细胞PPARα蛋白表达会受到模型组的类别影响，从实验的结果发现，各种剂型的鹿红方药物血清组对缺氧处理的H9C2 细胞会起到一定的保护作用，特别是都能增强H9C2细胞增殖活性，并可通过PPARα的表达上调，有效发挥其恢复和提升心肌组织功能作用，其中4组、6组、7组、14组、15组鹿红方药物血清组的功能作用最为明显。该结果提示鹿红方干预都具有明显上调PPARa的作用。

图1 Western blot实验结果

2.3 假手术组和鹿红方各组HE染色(见图2) 第16组假手术组大鼠的心肌细胞边界欠清，胶原纤维呈无序散乱缠绕状，且有梗死透壁现象，空泡坏死面积大；中药组的大鼠心肌纤维呈现束状排列，心肌细胞、胞浆大小相对比较一致，形态规则，胶原纤维排列定向、紧密、整齐，基本无空泡，1组、2组、3组、6组边缘有部分炎症出现，成纤排列有序且基本无空泡炎症。14组、12组、10组边缘亦有炎症出现，室壁中层有少量空泡，成纤排列基本有序；第15组西药组部分空泡化及部分炎症，成纤细胞排列较散乱，但排列比对照组稍紧密。鹿红方让无序的纤维定向排列，使心衰心脏的心功能得以改善。

图2 大鼠心肌HE染色

2.4 病理组织VG染色(见图3) 第1组、2组、6组、8组、10组红色为胶原纤维，表明此处渗透性大。第15组、16组的空隙表明组织渗透性弱。第6、10组纤维化后VG染色明显呈红色，表示胶原纤维构成的疤痕形成，可能是原来心肌纤维被胶原胶原纤维代替，呈红色。

图3 大鼠心肌VG染色

2.5 胶原容积指数(ICVF) 是反应胶原纤维的量化指标，中药干预各组与假手术组比较，都有显著减少，其中第2组5.218%与第8组的5.198%相接近(见表2)，较其余各组的胶原容积指数稍高。第15组西药组ICVF为3.522%，疗效最显著。提示鹿红方各剂型虽比西药组略高，但胶原容积都明显少于假手术组，证明鹿红方对心衰病理改变有显著降胶原纤维的作用。

表2 胶原容积指数(±s)

2.6 血管周围胶原面积/管腔面积比值( PVCA) 第8组PVCA为4.94%，与假手术组比较，显著减少，但高于其他治疗组(见表3)。第11组PVCA3.644，疗效等同于第15组西药组(见表3)。说明鹿红方干预组都有显著降低 PVCA的功效，尤其是第11组，疗效等同于西药组。

表3 血管周围胶原面积/管腔面积的比值(±s)

3 讨 论

3.1 鹿红方组方原则 鹿角、桂枝、党参、黄芪、南葶苈子及红花等中药成分是鹿红方的主要原料来源。精选这六种药材，主要考虑到：鹿角，温肝益肾、补行精血，上通于心；桂枝的功效一般是温心通阳；党参、黄芪，主要用来益气扶正，共为君药；葶苈子，则为泻肺平喘为佐使药，这六种药材融合使用，可以更好地调补阴阳、益气强心、活血通络之功效；红花，则可活血通经、散瘀解毒，共为臣药。这些知名药材的融合使用，便可产生益气强心、调补阴阳、活血通络的功效。鹿红方可以给予温阳活血法，能更好地改善心衰症状及生化指标，临床上对心力衰竭合并心绞痛的病人进行随机跟踪、比较、观察发现，鹿红方的综合治疗心衰疾病的效果特别明显：该方中医症候改善总有效率、NYHA心功能分级改善总有效率、改善Lee心衰计分系统总有效率分别为82.8%、89.7%、55.0%，中医证候疗效高达80%。同时，也进行了机制探讨，均证实鹿红方临床上是治疗充血性心力衰竭合并心绞痛中医辨证为心肾阳虚兼有血瘀的一个安全、有效的中药制剂。

3.2 PPAR作用机制 过氧化物酶体增殖物激活受体，是由Issemann和Green两位英国科学家通过克隆小鼠肝脏而获取的，实际上PPARs是一类核转录因子，配体PPARα主要是在线粒体丰富的肠细胞、肾近曲小管细胞、心肌细胞，以及肝细胞等诸多细胞中呈高水平表达[9]。PPARs主要是进行调节细胞分化、能量代谢、过氧化物酶体增殖和炎症反应等，这些变化主要存在于动脉粥样硬化、高血压、胰岛素抵抗、糖尿病及肿瘤等常见疾病的病理过程中[10]。实验表明，鹿红方可以影响PPARα基因表达，辅助心肌细胞在体内脂肪酸的活化、摄取、代谢等[11]。病理研究表明：鹿红方使得心肌代谢基因表达的PPARα中间控制作用被激活，通过恢复PPARα活性而潜在保护心脏，用于心肌肥大和心衰的治疗[12]。

根据上海曙光医院周华教授多年的临床实践，结合中医理论所蕴含的“治心之所以治肾、而治肾之所以治心”理念，并在巩固推广多年临床治疗心力衰竭经验成果的基础上，探索研制由鹿角、桂枝、黄芪、党参、红花和葶苈子等中药材组成的特效药方鹿红方，兼具通络活血、调和阴阳、补心温肾等多重功效。研究证实，鹿红方在标本关系处理上，注重以益气、扶正、治本为主，配以活血治标为辅助；在调和阴阳上，特别注重平补阴阳，以补阳为主；在心肾关系处理上，尤其强调心肾融合、心本乎肾，以温肾促强心。对于各单味药的研究，据记载：鹿角通常用以补肾壮阳，虽具有补脑强心的效能，却很少用来延缓心力衰竭等病症；现代医学临床表明，鹿角可以更好地改善蛋白质代谢障碍，加快能量代谢。黄芪可以促进肌体发育生长，增强肌体活动能力。党参可以减轻身体疲劳，改善睡眠食欲[13]。对于红花，主要通过热水来提取，这种提取物具有显著地抗血凝的作用，且对活化某些凝血活酶时间起到很好效果，同时也对胶原诱导的血小板和二磷酸腺苷(ADP)的聚集起到很好的抑制作用，并促使纤维蛋白溶酶和尿激酶的纤溶作用得到进一步加强[14]。这些中药的医疗机制，有助于心力衰竭进程进行合理地调控和延缓，进而逐步缓解心衰病人的心绞痛症状。

综上所述，作为一种治疗心衰病人的特殊中药，鹿红方不但可以缓解甚至在某些时刻阻断病人心力衰竭进程，适度减轻心绞痛等各种不良心脏病症；如此，心衰病人不但可以增强参与心衰治疗的信心，也可逐步提高治疗的实效，同时病人的生活品质也可得到很大提升。

因此，通过多年的探索研究提出，鹿红方临床实践效果明显，可以作为一种治疗充血性心力衰竭的安全药物，特别是在今后治疗心衰病人的临床中进一步更大范围的推广。

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(本文编辑王雅洁)

Effect of Luhong Prescription on Peroxisome Proliferator-Activated Receptor and Myocardial Tissue in Mouse with Chronic Heart Failure

Rong Jinfeng，Feng Zhou，Liu Qian，Zhou Yaozhong，Wang Yong，Fang Hongjun，Zhou Hua

Shanghai Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai，China

Zhou Hua

Objective To observe the effects of Luhong prescription (LHP) on peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) and myocardium of mouse with congestive heart failure (CHF).Methods Separation water decocted solution of LHP was eluted with distilled water，30% ethanol and 60% ethanol，95% ethanol，extract，respectively，as a，B，C，D solution，grouped into A，B and AB，C，AC，BC and ABC，D，ad and BD，abd，CD，ACD，BCD in a total of 14 groups，group 15 (trimetazidine) and group 16 (sham operation group)，respectively.Ninety-six rat models of CHF were established by coronary artery ligation and administrated by intragastric administration.The protein expression of PPARα on cardiomyocyte was detected by western blot (WB).The pathological structure of myocardial tissue was observed by Haematoxylin-Eosin (HE) staining and Van Gieson (VG) staining.Results LuHong prescription can upregulate the function of PPARa obviously,it can make the muscle fiber orientation disordered,it can make the heart to improve the heart function of chronic heart failure.LuHong prescription can reduce collagen on the pathological changes of heart failure. LuHong prescription can reduce the efficacy of PVCA significantly.Conclusion LHP can upregulate the protein expression of PPARα on cardiomyocyte in rats with CHF.

Luhong prescription；heart failure；peroxisome proliferator activated receptor；myocardial tissue

国家自然基金面上项目(No.81373625)；国家自然科学基金青年科学基金(No.81303798)

上海中医药大学附属曙光医院(上海 201203)

周华，E-mail：zhouhuam@hotmail.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.03.010

1672-1349(2017)03-0293-05

2016-11-13)

引用信息：戎靖枫，封舟，刘茜，等.鹿红方对心力衰竭大鼠过氧化物酶增殖物激活受体和心肌组织的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志，2017，15(3)：293-297.