植物体细胞杂交技术的几点疑问解析

苏杜林

(甘肃省礼县实验中学 742200)

植物体细胞杂交是指将不同种的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新植物体的技术。其过程主要包括原生质体的制备、细胞融合的诱导、杂种细胞的筛选和培养以及杂种植株的再生和鉴定等环节。

1 植物体细胞杂交的原理

植物体细胞杂交首先要使原生质体融合形成杂种细胞；其次要把杂种细胞经过植物组织培养技术培育成杂种植株。细胞融合的原理是细胞膜具有一定的流动性，植物组织培养的原理是植物细胞的全能性。因此，植物体细胞杂交的原理是：利用细胞膜具有一定的流动性和植物细胞的全能性进行育种。

2 如何制备原生质体

植物细胞外面坚硬的细胞壁是细胞融合的障碍，因此在体细胞杂交前必须除去细胞壁，获得具有活力的原生质体。

除去细胞壁早期的方法是机械法，即通过将材料置于高渗糖溶液中,使其发生质壁分离,当原生质体收缩成球状时,切开细胞壁释放出原生质体。但由于这种方法费时、繁琐且不易获得完整的原生质体,目前已基本上被酶解法取代。酶解法是用不同种类和浓度的酶处理植物细胞, 将细胞壁解离,以获得原生质体的方法。由于植物细胞壁的主要成分为纤维素、半纤维素、果胶等，所以酶解法去壁常用的酶主要有纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶等。正常状态下,细胞壁对原生质体具有保护和支持作用。但在制备原生质体时将细胞壁去除后, 裸露的原生质体很可能由于其内外渗透压的不同而发生吸水胀破或失水皱缩。因此,在酶液中必须加渗透稳定剂以保护原生质体的活力和质膜的稳定性。此外，酶液的浓度为使细胞发生轻度的质壁分离为宜[1]。

3 如何诱导原生质体融合

诱导原生质体融合的方法有化学诱导和物理诱导两种。化学法又可分为离子诱导融合法、高钙-高pH法、PEG(聚乙二醇)法等。离子诱导融合法常用的盐类离子有硝酸钠、硝酸钾、硝酸钙、氯化钙等。由于PEG法对原生质体毒性小、易操作、成本低、不需特殊设备，融合子产生的异核率较高，且融合过程不受物种限制。因此，该方法在植物体细胞杂交中被广泛使用。物理诱导融合方法有离心、振荡、显微操作和电融合等。目前,电融合法得到广泛应用。电融合法是在融合仪的控制下在融合小室内进行的，其突出的优点是各种指标都可精细调节控制，融合效率均比其他方法高[2]。

4 如何筛选异型核的杂种细胞

原生质体间的融合是随机的，两个不同亲本的原生质体混合后经诱导融合，实际上得到的是各种原生质体的混合物，包括异核体(AB型)、同核体(AA和BB)以及未发生融合的双亲原生质体(A和B)。而植物体细胞杂交的目的是要突破不同种属的植物远缘杂交不亲和的障碍，获得具有双亲遗传特性的新的植物类型。因此，需要通过筛选获得异核体即杂种细胞。

筛选杂种细胞的常用方法有：①互补选择法。这种方法的原理是利用现成的或诱发产生的各种缺陷型或抗性型的突变体细胞作为融合实验的材料。由于突变体均不能在特定的选择性培养基上生长，而能在该培养基上正常生长的是互补的杂种细胞，因此可将其筛选出来。②机械选择法。利用两种原生质体的某些可见标志(如形态、颜色等差异)，对融合产物进行鉴别，筛选出杂种细胞进行单独培养。对于在形态、颜色上难以区分的原生质体融合形成的异核体，可利用不同荧光素分别标记两亲本的原生质体，然后进行诱导融合，在荧光显微镜下选择同时带有两种荧光标记的杂种细胞[3]。③组织培养筛选法。根据植物细胞对培养基成分和培养条件的要求与反应不同，可作为选择杂种细胞的依据。利用这种特性或人为地造成杂种细胞生长和分化能力的差异来进行杂种细胞的选择[4]。

5 如何鉴定杂种植株

在杂种植株的鉴定工作中，传统方法常利用形态学特征[4]作为鉴定指标。例如，叶片的大小、形状、叶脉、叶柄，花朵的颜色与结构等特征作为鉴定指标。但这种方法很难将杂种细胞的变异与非整倍体或培养条件引起的体细胞克隆的无性系变异区分开来。

细胞学染色体的观察也是鉴定杂种植株的常用方法。因为自然物种的染色体数是恒定的。不过，通过染色体数和染色体显带技术来鉴定特异的染色体，往往不能排除培养过程中所造成的染色体丢失等变异。

在体细胞杂种鉴定中应用最普遍的生化方法是同工酶分析法。其依据是体细胞杂种的同工酶谱可表现为双亲酶带的总和，或同时出现双亲特有的谱带，或者也有可能出现新的杂种带和丢失部分亲本带[1]。

目前，应用 DNA重组技术从分子水平上来鉴定杂种的方法受到很多科学家的青睐。由于每个物种都有其特定的RFLP图谱，即限制性内切酶片段长度多态性指纹图谱。用物种特异的重复DNA作探针，与 DNA限制片段杂交以后，就可以根据特异的图谱鉴定出杂种[2]植株。

6 如何确定杂种植株的染色体数目和基因型

植物体细胞杂交即两个细胞融合成一个细胞，如果不发生细胞核或染色体的丢失，则不管染色体数、基因型、基因组数还是染色体组数都是两者之和，属于染色体变异。例如，某植物细胞含2N条染色体，2个染色体组，基因型为AaBb；另一植物细胞含有2M条染色体，2个染色体组，基因型为ccDd。则杂种植株细胞含染色体2N+2M条，含染色体组4个，属于4倍体，其基因型为AaBbccDd。

7 杂种植株可育吗

单从理论上分析，杂种植株是否可育，取决于其能不能正常进行减数分裂，产生正常的生殖细胞，如若可以则是可育的，否则就是不育。例如，两种亲本细胞都是二倍体，杂种细胞就含有双亲细胞的各两个染色体组，能够进行正常的减数分裂，产生正常配子且是可育的；如果是两种植物的花粉细胞杂交的杂种植株，由于染色体不能正常联会形成正常配子，就是不育的，但若用秋水仙素处理，使染色体数目加倍，就能正常进行减数分裂，产生正常配子且就成为可育的了。而现实的情况是，杂种植株的形成过程中往往会发生细胞核或染色体的丢失等现象，大多不能形成正常配子且是不育的。