提高“DNA粗提与鉴定”实验开出率的思考与探索

霍 静

(西南大学生命科学学院/西南大学科学教育研究中心 重庆 400715)

李妞妞 曾令江

(西南大学生命科学学院 重庆 400715)

20世纪中后叶，分子生物学开发了一套人工操作DNA的技术，揭开了基因工程的序幕。目前，提取DNA已经有了较为成熟的方法，常用的有CTAB法、SDS法、盐析法等[1]，甚至用一些特殊的方法还能获得标本中“痕量级”DNA。中学学习DNA的提取，旨在结合学生已有知识，学会实验研究的思路和方法。人教版教材就是利用“渗透吸水”和“盐析”的原理，引导学生理解DNA提取的实验设计。为了便于中学开出更具有操作性的DNA提取和鉴定的实验，本文尝试解析DNA粗提的实验原理，并对实验方法进一步改进，寻找一个适合在一节课中完成的实验方案，为在中学更好地开设出该实验提供理论和方法的指导。

1 实验原理的解析

1．1 提取液的基本成分 从活细胞中获取DNA，需要先构建一个细胞的立体图景，才能更好的确定出实验的基本思路，理解提取液的基本成分。细胞中的DNA大部分稳定地存在细胞核中，线粒体和叶绿体中也有少量的DNA存在，细胞核和细胞器悬浮于细胞质基质中，细胞质基质是一个酶溶液，各种复杂的代谢反应在这里有条不紊的进行。

1.1.1 缓冲体系的建立 目前研究已发现细胞质基质是一个高度有序的体系，其中蛋白质与蛋白质之间，蛋白质与其他大分子之间通过弱键而相互作用，并处于动态平衡之中，一旦细胞破裂，依靠分子间脆弱的相互作用而形成的结构体系就会遭到破坏。所以在实验前，需要提供一个相对稳定的缓冲环境，使各种生物大分子基本维持其在细胞中的状态。在提取DNA的研磨液中Tris-HCl就是一种温和的缓冲液，它被广泛用作核酸和蛋白质的溶剂。Tris碱性较强，中文名“三(羟甲基)氨基甲烷”，用HCl调配出来，就称为Tris-HCl缓冲液。提取DNA的Tris-HCl缓冲液pH值为8，这种弱碱性溶液较好地维持了提取液的pH值，DNA被去质子化后，提高了DNA的溶解性。

1.1.2 DNA的核酸酶抑制剂 如果DNA离开了正常的生理位置，细胞质基质中的核酸酶会立即将其降解，以免干扰正常的生命活动。我们的汗液，唾液中也有大量的核酸酶，实验使用的各种器具也会带有核酸酶。在提取DNA之前，要尽可能先将这些核酸酶钝化，保护好DNA。乙二胺四乙酸(EDTA)是一种金属螯合剂，能螯合溶液中Mg2+、Ca2+、Mn2+、Fe2+等二价金属离子，而多数的核酸酶在发挥作用时需要Mg2+的参与，EDTA螯合了Mg2+，就能有效抑制核酸酶的活性。

1.1.3 DNA的溶解液 DNA在NaCl的盐溶液中，随着浓度的变化，溶解度也会发生变化。高浓度的NaCl(2 mol/L)溶液能溶解较多的DNA。同时，NaCl是一种中性盐，高浓度的盐溶液会破坏蛋白质的胶体性质，使其发生盐析，形成沉淀。这样就能在最初的提取环节，为DNA溶解和沉淀蛋白质做好准备。

1.1.4 在细胞膜上打洞 DNA包裹在细胞核的双层膜结构中，整个细胞又由细胞膜包被。实验要获得游离的DNA，需要打开膜的束缚。而生物膜主要由磷脂和蛋白质组成，只要能破坏磷脂的结构，膜的基本骨架就会瓦解。十二烷基磺酸钠(SDS)是一种离子型表面活性剂，对蛋白和油性污垢有较强的去除作用，在提取液中能有效破坏细胞膜的磷脂和膜蛋白，使细胞膜和核膜破裂。

在常用的洗涤剂中含有SDS的成分，所以洗涤剂具有较好地去除油渍的作用，但洗涤剂中不具备提取液中的其他成分，如果中学实验只选用洗涤剂和食盐的配比来研究DNA的粗提取，很难保证成功提取出DNA。

1．2 去除非DNA杂质 具体实验步骤如下：

1.2.1 保留上清液 经过提取液处理的材料，理论上大部分的DNA已经溶解在提取液中，在实验的体系中，还有大量不溶的物质，这些物质会干扰后面进一步从溶液中获取DNA。

所以，需要保留上清液，去除其他的杂质。可行的操作步骤是离心取上清，如果中学没有离心机，可以采用四层纱布过滤，收集提取液。

1.2.2 再次纯化DNA DNA是由核苷酸高度聚合而成的一种非极性的生物大分子，结构稳定，不溶于极性的无水乙醇(酒精)。而不同种类的蛋白质，由于带有不同数量的极性基团，乙醇就是很好的溶剂。纯化DNA时，可以将收集到的上清液加入等体积或2倍体积的无水乙醇中，静置2～3 min，白色的DNA就会呈丝状沉淀出来。

1.3 鉴定DNA 在中学一般采用二苯胺试剂的显色反应，较便捷地鉴定DNA。DNA在酸性条件下加热，其嘌呤碱与脱氧核糖间的糖苷键断裂，生成嘌呤碱、脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷酸，其中的脱氧核糖在酸性环境中加热脱水生成ω-羟基-γ-酮基戊醛，能与二苯胺试剂反应生成蓝色物质，如果鉴定溶液显浅蓝色，就证明提取出了DNA。

2 实验成功的关键问题思考

2.1 实验材料的选取 人教版教材选修1《生物技术实践》中通过基础知识的梳理，整理出了盐析提取DNA的实验设计，在实验材料选择时提供了“鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌”作为材料的备选，并提示实验可以比较哪种材料中的DNA含量更高。

如果以血液作为实验材料，能方便的破碎细胞，但现有研究表明“哺乳动物的红细胞一般是释放到外周血中已经不含有细胞核的网织红细胞，即便是非哺乳类动物的红细胞也属于高度特化的细胞种类”；选取洋葱的肉质鳞片，这种变态叶是一种贮藏组织；香蕉、猕猴桃是已经成熟的果实；豌豆是种子；猪肝是高度特化的组织……这些材料内蛋白质或糖类等的含量较高，仅用粗提的实验原理，很难较好地分离出DNA，在析出DNA的环节，会得到较多的非DNA的粘稠黄白色混合物，甚至无法用二苯胺试剂检测到DNA的存在。

在实验材料选择时推荐DNA含量相对较高、蛋白质等杂质含量较少、颜色较浅的生物材料[2]。菜花容易在菜市购买到，在有温室大棚蔬菜提供的城市也不受季节的影响，其中有大量的细胞在进行旺盛地分裂，细胞内DNA含量较高，其他生物大分子的含量不多，也没有叶绿素的干扰，能通过研磨破碎细胞。培养的大肠杆菌也是提取DNA的好材料，在不具备培养大肠杆菌的实验室，取材会受到限制。如果选用植物幼嫩的芽尖提取DNA，去除非DNA杂质时还需要加入氯仿等洗涤色素蛋白的步骤。所以，综合考虑推荐中学选择菜花作为实验材料。

2.2 充分研磨 从实验安全的角度考虑，不建议在液氮环境中研磨材料。根据中学的实际情况，在有提取液的条件下破碎细胞，才能更好地获取细胞中的DNA。植物细胞被纤维质的细胞壁保护着，只有打开细胞壁才能让细胞的内容物充分地流出，所以在实验中充分研磨是必要的。在5 mL的提取液中，称取2 g～5 g的材料(并不是材料越多越好)迅速研磨匀浆至肉眼看不见小颗粒。研磨过程要求尽可能快，保证细胞内含物能尽快与提取液混匀，避免DNA被降解。

2.3 避免加入与实验无关的药品 DNA提取要尽量避免蛋白质和DNA一起溶解在滤液中，嫩肉粉的主要成分为蛋白酶，它能将结构复杂的不溶于水的蛋白质大分子分解为能溶于水的小分子，增加了后期纯化DNA 的难度。

而且，细胞中提取的DNA来源于由蛋白质参与盘曲折叠形成的高级结构——染色体，蛋白酶在分解蛋白质的时候，会破坏DNA的完整结构，导致无法获得理想的DNA提取物。

3 可供参考的DNA粗提与鉴定方案

根据影响实验成败的因素分析，在实践的基础上，整理出适合在1节课完成的实验操作步骤(表1，见后页)，供中学生物学教师参考。

(基金项目：西南大学实验技术研究项目，No.SYJ2016049)

表1用菜花提取DNA的实验操作步骤

步骤方法操作时长(共35 min)研磨称取剪好的菜花2～5 g于研钵中,加入5 mL研磨液,充分研磨至匀浆状(研磨液:称取1.01 g Tris试剂放入100 mL烧杯中,用50 mL蒸馏水溶解,再用2 mol/L的HCl将溶液酸碱性调到pH=8.0,即成为Tris-HCl缓冲液。然后再分别加入8.76 g NaCl、3.72 g EDTA(乙二胺四乙酸)、2 g SDS(十二烷基磺酸钠),溶解后再加水定容到100 mL)2～5 min过滤在漏斗上垫四层用水润湿的纱布,收集过滤研磨好的菜花滤液(若自然过滤速度过慢,可以戴上一次性手套挤压;有条件的实验室可采用3000 rmp、离心5～10 min的方法;若转速更快,还可以缩短时间)2～5 min析出将滤液加入盛有两倍体积冷冻无水乙醇的塑料离心管中,静置。观察白色絮状物析出4～5 min5 min鉴定取A、B两支试管,分别加入2 mL蒸馏水,用玻璃棒将白色絮状物挑起放于B试管中,搅拌使其充分溶解;向两支试管中各加入2 mL二苯胺试剂(现配现用)在沸水浴中加热,观察现象。15 min