真菌感染检测方法的研究进展

余菁 马越娥 史玉玲

(同济大学附属第十人民医院皮肤科，上海 200072)

·综述·

真菌感染检测方法的研究进展

余菁 马越娥 史玉玲

(同济大学附属第十人民医院皮肤科，上海 200072)

近年来，随着抗生素、免疫抑制剂和激素等的广泛应用，真菌感染有不断上升的趋势，真菌已成为医院感染的常见病原菌之一。由于不同病原菌对抗真菌药物的敏感性不同，能否准确诊断病原菌直接影响药物的选择。及时准确地检测真菌感染以及确定菌种，在临床治疗中尤为重要。该文对真菌感染检测方法的研究进展作一综述。

真菌感染；病原菌；检测方法

真菌感染是指一种或多种真菌侵犯机体组织，由真菌或其代谢产物引起的疾病,其范围可从浅表感染到深部组织感染。近年来，真菌感染发生率不断上升，真菌的继发感染问题也越来越多[1]。真菌检测对临床的诊断与治疗尤为重要，随着真菌检测技术的发展，有越来越多的方法可以应用于真菌的检测和鉴定。

1 真菌镜检

真菌镜检是应用最为普遍的真菌检查。最常用的是10%～20%KOH溶液涂片法，操作简便，能够快速判定有无真菌感染，但其不能鉴定菌种，而且由于缺乏颜色对比，需要观察者有很熟练的检查技术，导致存在5%～15%左右假阴性[2]。在KOH中加入二甲基亚砜 (DMSO)后可以快速溶解角质而不需加热，更容易辨认真菌结构，并能与人工假象相区别。通过提高KOH浓度及添加渗透剂DMSO，可促进角质细胞化学变性，使背景清楚，减少纤维织物和细胞间隙干扰，易于辨认，特别是针对指、趾甲标本有其优越性[3]。此外，还有许多特殊的染色方法，可以使真菌结构更加清晰可辨。

1.1 荧光染色

目前，多种荧光染料 (包括异硫氰酸荧光素、Solophenyl Flavine染料、Calcofluor White染料等)由于与真菌细胞壁的纤维素或几丁质有很强的亲和力而被用于真菌的染色上，使各类真菌 (霉菌及酵母)的细胞壁产生荧光标记，包括皮肤癣菌、马拉色菌、念珠菌、曲霉及各类变异的菌丝结构,而且特异性高，反应时间只需数秒钟即可完成，大大提高了临床真菌检测灵敏度和效率。适用于皮屑、甲屑、毛发、痰液、肺泡灌洗液、尿液、胸水等各种标本。荧光染色后，真菌 (菌丝和孢子)在镜下为清晰的亮蓝色，菌丝的横隔结构和孢子的出芽形态清晰可见，非常易于识别。特别是在KOH涂片中真菌孢子与脂肪滴有时很难鉴别，而荧光染色法对脂肪滴不产生标记，使得特异性大大提高，弥补了传统的KOH涂片法在真菌数量少时检出率不高的不足。已有许多文献证实荧光染色法在真菌检测中较传统的KOH湿片法具有敏感性强、阳性率高的特点[4]。在具备荧光显微镜的条件下，荧光染色法可取代传统的KOH湿片法，成为常规真菌镜检的一种优良检测方法[5]。

1.2 派克墨水染色

派克墨水染液的配制：用20%KOH溶液和派克墨水各半混匀即成。经派克墨水染色的标本在镜下菌丝、孢子均被染成蓝色,而背景上的角质细胞、脂滴、气泡均不着色,对比鲜明,尤其利于马拉色菌孢子与背景脂滴、气泡的鉴别,在低倍镜下即可迅速发现目标孢子。

1.3 乳酸酚棉蓝染色法

乳酸酚棉蓝染色是比较常用的一种染色方法，染色后菌丝和孢子呈深蓝色，形态结构清晰，背景干净，反差大。乳酸可杀灭真菌，棉蓝可使其着色，甘油可使玻片长期保存[6]，可以提高镜检阳性率。

1.4 过碘酸雪夫 (PAS)染色

PAS染色镜检可看到真菌呈红色或紫红色，胞核蓝色。其原理是由于真菌荚膜有多糖类物质，过碘酸能氧化真菌壁的多糖而暴露出醛基，醛基与无色品红结合又能生成新的红色品红复合物。PAS对真菌染色特异性强，着色鲜艳，易观察，比较简单方便，是鉴别真菌非常好的方法，值得推广[7-8]。目前多用于深部真菌病理切片的真菌染色。

1.5 芝加哥天蓝染色

芝加哥天蓝染色即用1 g固体芝加哥天蓝加入到100 mL 10%KOH充分溶解用于涂片，镜下可见蓝色的孢子及菌丝，及淡红色的皮屑等杂质背景，形成鲜明的色彩对比，这对于在低倍镜下或技术不够熟练的观察者，能更快速发现真菌的菌丝及孢子等特征结构。芝加哥天蓝涂片镜检提供了一个更快速、准确的诊断方法，已有用于浅表真菌感染检查的报道[9]。

1.6 六胺银染色

六胺银染色使真菌菌丝和孢子呈明显的黑褐色，细胞核红色。其原理是用5%铬酸氧化真菌内的多糖化合物而暴露出醛基，醛基还原六胺银成为黑色的金属银[8]。

1.7 其他

除上述染色方法外，还有苏木精-伊红 (HE)染色、革兰染色、抗酸染色、嗜银染色、吉姆萨染色、黏蛋白卡红染色、子囊孢子染色、美蓝染色、Seller染色、Gridley染色、Wright染色等多种方法可用于真菌的染色检查。

2 真菌培养

真菌培养检查是将待测标本在一定温度和湿度下进行培养，2～4周后根据生长真菌的菌落形态和镜下结构进行菌种鉴定。临床上常用真菌培养基有沙氏葡萄糖琼脂培养基 (SDA)、马铃薯培养基 (PDA)。SDA是将葡萄糖40 g、蛋白胨10 g、琼脂18～20 g加入烧杯或铝锅内，加少量蒸馏水加热溶解，待完全溶解后补足蒸馏水至1 000 mL，分装试管，115℃ 10 min高压灭菌。SDA主要用于临床真菌常规培养。PDA即把铃薯200 g，洗皮切成碎块，加水煮沸20 min，纱布过滤，滤液中加入琼脂20 g，葡萄糖20 g，加热使之溶化，再补足蒸馏水至1 000 mL，分装，高压灭菌。PDA可用于真菌的培养及曲霉菌和青霉菌的鉴定。此外，还有许多常用的培养基[10]。

2.1 改良沙氏琼脂培养基

根据不同用途可以将沙氏琼脂培养基进行改良，加入维生素B 0.1 mg/mL，可以促进紫色毛癣菌和断发毛癣菌生长繁殖；加入酵母浸膏5 mg/mL，可促进皮肤癣菌生长。

2.2 科马嘉 (CHROMagar)显色培养基

科马嘉显色培养基是一种新型的鉴定培养基，能对临床常见的假丝酵母菌进行分离并根据菌落的颜色快速鉴定常见菌种[11]。根据培养基上生长菌落的颜色和形态进行判断：绿色菌落为白色假丝酵母菌即白念珠菌，蓝灰色菌落为热带念珠菌，粉红色、边缘模糊、有微毛的为克柔念珠菌，紫红色为光滑念珠菌，白色为其他念珠菌属。对于混合感染的标本，也可以根据菌落在培养基上呈现的不同颜色作出判断。用科马嘉显色培养基快速鉴定常见念珠菌属，目前已广泛应用于临床真菌培养。

2.3 米饭培养基

米饭培养基即按1 g大米、3 mL水的比例放入试管或培养皿中，121℃ 15 min高压灭菌备用。可用于鉴别非典型的羊毛状小孢子菌和奥杜盎小孢子菌，还能促进许多皮肤癣菌产生其特征性分生孢子，有助于菌种鉴定。

2.4 玉米粉吐温琼脂

玉米粉吐温琼脂即将玉米粉50 g混于水中，65℃水浴1 h，过滤，蒸馏水补足1 000 mL，再加入葡萄糖2 g、琼脂15 g、吐温-80，121℃ 10 min高压灭菌后分装，冷却后冰箱保存。它能促进红色毛癣菌产生深红色色素，可用于红色毛癣菌的鉴别。如不加葡萄糖，玉米粉吐温琼脂可用作念珠菌鉴定的小培养，以促进白念珠菌假菌丝和厚壁孢子的形成，也会促进暗色孢科真菌孢子的形成。

2.5 尿素琼脂

尿素琼脂是将葡萄糖10 g、蛋白胨1 g、NaCl 5 g，KH2PO42 g，0.02%酚红水溶液6 mL，蒸馏水1 000 mL混匀后调pH至6.8,加入琼脂20 g，煮沸至琼脂完全溶解，10 min高压灭菌，取出后冷却至45～50℃时，每450 mL培养基中加入抽滤灭菌的20%尿素溶液50 mL，混合均匀后分装斜面，冷却后备用。新生隐球菌等一些隐球菌和一些酵母能够产生尿素酶，而许多其他酵母却不能产生尿素酶，尿素酶能分解培养基中的尿素，并形成大量的氨，使培养基pH值升高而呈碱性，使酚红指示剂变红，因此尿素琼脂可用于隐球菌的鉴定。另外皮肤癣菌的尿素酶试验用含5%葡萄糖的此培养基，用于鉴别红色毛癣菌和须癣毛癣菌。

2.6 其他

除上述培养方法，常用的培养基还有咖啡酸琼脂，用于鉴别新生隐球菌；芽管实验培养基，可鉴定白念珠菌；脑心浸膏琼脂 (BHI)，双相真菌可在该培养基上呈酵母相；卡菌鉴定培养基，鉴定奴卡菌与链霉菌；葡萄糖酵母汁蛋白胨液体基，可分离培养酵母菌；子囊琼脂、石膏块培养基，可培养酵母菌产生子囊孢子；Leeming和Notman培养基、橄榄油培养基、七叶苷琼脂可用于培养鉴定马拉色菌；皮肤癣菌鉴别琼脂 (DTM)，用于鉴定皮肤癣菌等等。

3 真菌检测方法的新进展

针对真菌感染，除了通过真菌培养菌落特征来鉴别常见菌种，目前有越来越多的新的真菌检测方法，在检测是否有真菌感染、抗真菌药物有效性及准确鉴定各种菌种等方面起到了重要作用。

3.1 分子生物学检测

目前，常用的分子生物学分型方法有很多，包括多聚酶链式反应 (PCR)、分子杂交、随机扩增片段长度多态性 (RAPD)、脉冲场凝胶电泳 (PFGE)、限制性片段长度多态性聚合酶链反应 (PCR-RFLP)、多位点序列分析 (MLST)、重复序列PCR、实时荧光定量PCR (FQ-PCR)、任意引物聚合酶链反应 (AP-PCR)、单链构象多态性分析 (SSCP)、DNA序列分析、基因芯片技术等。其中MLST技术是目前公认的最为权威客观的分子分型方法[12-14]。其基础是通过PCR技术，分析真菌rDNA和ITS核酸序列，从基因水平上分析各菌种之间的亲缘关系，使得菌种鉴定更加准确、可靠。rDNA基因是一种串联重复基因，其序列和重复次数有显著的株间差异，可用于种水平的鉴定[15]。rDNA上的18S、5.8S、28S rDNA基因序列进化速率慢且相对保守，存在广泛的异种同源性，其中小亚基18S rDNA序列常被用来研究属及属以上分类群的演化关系，大亚基28S rDNA中的D1/D2区域可用于属及临近等级的分类群[16]。rDNA间的间隔区为内转录间隔区 (ITS)，由于进化相对迅速而具多态性，因而适合于等级水平较低的系统学研究。Schoch等提出rDNA ITS作为真核生物域的第二大界——真菌界的DNA条形码，以利于真菌多型分类生态学和生物多样性的研究[17]。

3.2 质谱技术

20世纪80年代以来，有4种软电离质谱技术产生，分别为等离子体解吸质谱技术 (PD-MS)、基质辅助激光解吸电离技术 (MALDI-MS)、快原子轰击质谱技术 (FAB-MS)和电喷雾质谱技术 (ESI-MS)。其中，MALDI和ESI两种技术突破性解决了极性大和热不稳定类蛋白质以及相关生物大分子的测定问题，具有高灵敏度、高准确度等优点。在此基础上，相关衍生和串联技术也不断产生，如PCR-ESI-MS、MALDI-TOF-MS等。其中，MALDI-TOF-MS是目前应用最为广泛的一种质谱技术[18]。它通过直接检测生物标志物 (蛋白)鉴定病毒、细菌、真菌及分枝杆菌,具有高敏感性、高通量和快速的特点。不同真菌通过质谱仪得到不同的蛋白质图谱,与数据库进行比对,根据图谱的匹配度,得出鉴定结果和相应的鉴定分值,分值越高匹配度越好,结果越可信[19]。因此，质谱法准确性依赖数据库中菌株种类，实验室需不断更新和补充数据库。质谱技术在酵母菌属鉴定应用比较广泛，数据库已包括了大量临床酵母菌的参考图谱，常用于鉴定常见酵母菌 (白假丝酵母、光滑假丝酵母、热带假丝酵母、克柔假丝酵母和近平滑假丝酵母)，准确率高[20]。Ranque等发现质谱仪对以下丝状真菌鉴定效果较好，包括曲霉菌、青霉菌、毛癣菌、镰刀菌、木霉和毛霉目，特别是临床常见的曲霉菌。但是数据库中只有少量的丝状真菌参考图谱，标本的制备程序复杂还需改进。另外，丝状真菌的图谱很容易受到真菌不同阶段的产物包括孢子、子实体、表面菌丝和基内菌丝体等的影响[21]。

3.3 1,3-β-D-葡聚糖定量分析 (G试验)

所有真菌的细胞壁均含有1,3-β-D-葡聚糖，而其他微生物及人的细胞和细胞外液都不含这种成分。当真菌进入人体血液或深部组织后，吞噬细胞的吞噬、消化等作用使1,3-β-D-葡聚糖从胞壁中释放出来，使其在血液及其他体液 (如尿液、脑脊液、腹水、胸腔积液等)中的含量增高,而在浅部真菌感染中不增高。因此，通过检测血清或体液中1,3-β-D-葡聚糖的含量，可以更早、更灵敏、更直接反映深部真菌感染的程度。该办法适用于除隐球菌和毛霉菌外的所有深部真菌感染的早期诊断，尤其是念珠菌和曲霉菌，但不能确定菌种和菌属[22]。

3.4 半乳甘露聚糖检测 (GM试验)

GM是曲霉菌细胞壁的主要成分，被认为是曲霉菌感染后最早释放入血的标志性抗原，其释放量与菌量成正比，可以反映感染程度。GM实验是侵袭性曲霉菌感染的早期诊断方法，有学者报道，外周血检测出GM的时间比临床症状早5～8 d，比经验性治疗平均时间早12.5 d[23]。

3.5 流式细胞术 (FCM)检测

FCM适合对真菌细胞逐个进行快速多参数的精确测量，目前主要用于白念珠菌的检测。以标准珠作为对照，可以测量真茵细胞的总DNA含量、细胞周期及增殖指数 (PI)，若细胞总DNA含量相等，说明是相同种属的菌株。同时，根据测出的细胞周期及增殖指数可以判断真菌的生长情况。此外，FCM还是一种快速、准确的药敏试验方法。其原理是抗真菌药物与真菌作用需要一定时间，通过药物介导细胞损害，利用某些荧光染料不能进入活菌细胞，只进入死细胞并同其内DNA或RNA结合产生荧光的特点，使用FCM检测死细胞和活细胞的荧光值，借以区分死菌和活菌，并依据荧光强度的变化趋势推断最小抑菌浓度 (MIC)[24]。

3.6 电镜技术

电镜技术包括扫描电镜、透射电镜、超高压电镜、分析电镜等。其中，应用最多的是扫描电镜。扫描电镜对观察研究真菌表面超微形态是一种重要的手段。在SEM下可清晰地分辨出真菌的菌丝和大、小分生孢子，为真菌的病原学分类和抗真菌药物筛选等方面提供形态学依据[25]。

3.7 活体共聚焦显微镜 (IVCM)

IVCM是一种活体生物检查技术，通过对角膜组织进行三维空间的扫描，动态观察角膜组织细胞形态，具有高分辨率、高图像对比度的特点，且重复性好[26]。IVCM对感染性角膜炎中棘阿米巴性角膜炎及丝状真菌性角膜炎的诊断具有重要应用价值。2011年Vaddavalli对103例微生物检查确诊的阿米巴角膜炎或真菌性角膜炎使用IVCM检查，发现敏感性为88.3%，特异性为91.1%，与金标准诊断结果的一致性非常好[27]，但很难对真菌的菌属及类型进行鉴定。

3.8 傅里叶变换衰减全反射红外光谱法 (FTIR-ATR)

傅里叶变换红外光谱分辨率高，可以反映微生物细胞壁、细胞膜、细胞质甚至细胞核中的蛋白质、多糖、脂质、核酸及其大分子、水分等混合成分的分子振动信息。因其主要根据细胞中生物大分子的化学组分进行分类，结果与传统的真菌分类系统有一定的差别。其与聚类分析方法相结合，使所有测试在种水平上都得到正确归类，但在属、科等种以上等级的分类结果跟传统的真菌分类系统有差异。目前，傅里叶变换红外光谱技术已成功应用于细菌、真菌、酵母菌、放线菌等微生物的识别[28]。

4 其 他

此外，真菌药敏试验、组织病理、微生物自动鉴定系统、隐球菌荚膜抗原检测、循环抗原检测、循环抗体检测、外抗原实验、皮肤实验等方法也可用于真菌感染的检测和鉴定。

5 结 语

目前，对于皮肤及甲的真菌感染，最常用的还是真菌镜检和培养，荧光染色因其操作简单、快速、灵敏度高的优点也开始广泛应用于临床。对于深部及皮下组织真菌感染，组织病理是诊断的金标准。G试验、GM试验和隐球菌荚膜抗原检测是目前临床常用的真菌血清学试 验。分子生物学、流式细胞术等先进的诊断试验由于种种原因，在我国各级医院尚未能顺利展开。新兴的质谱技术及其相关衍生和串联技术凭借其快速、操作简单、稳定可靠等优点,相信在未来临床致病真菌鉴定中将具有很大优势。随着科研人员的不断研究和科技的不断进步，会有越来越多的技术应用于真菌的检测，为临床诊断和治疗提供指导。

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[本文编辑] 王 飞

余菁，女 (汉族)，硕士研究生在读.E-mail:2280994954@qq.com

史玉玲,E-mail:shiyuling1973@tongji.edu.cn

R 379

B

1673-3827(2017)12-0252-05

2017-02-12