漆酶及其在酿酒工业中的应用研究进展

常晨，梁敏，包怡红*

（东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨150040）

漆酶及其在酿酒工业中的应用研究进展

常晨，梁敏，包怡红*

（东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨150040）

漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，在造纸、生物漂白和食品等领域得到了广泛研究与应用。该文综述了漆酶的来源与分布、结构、性质以及其在酿酒工业的应用研究进展，包括在保持啤酒稳定性、葡萄酒澄清、测定葡萄酒中某些化合物和作为葡萄孢灰霉感染指示剂等方面，并展望了漆酶在酿酒工业的发展前景。

漆酶；酿酒工业；应用；研究进展

漆酶（laccase）EC 1.103.2又称苯二醇；氧化还原酶（ρ-diphenol：oxygen oxidoreductase）是一种含铜的多酚氧化酶（polyphenoloxidases，PPO），和植物中的抗坏血酸氧化酶（ascorbic acid oxidase）、哺乳动物的血浆铜蓝蛋白（ceruloplasmin）同属蓝色多铜氧化酶（blue multi-copper oxidase）家族[1]。

1 漆酶的来源和分布

漆酶按其来源主要分为漆树漆酶（rhus laccase）、真菌漆酶（fungal laccase）、细菌漆酶（bacterial laccase）和动物源漆酶[2]。1883年，YOSHIDA在漆树（Rhus vernicifera）中发现漆酶，后来在真菌中也检测到漆酶的存在。真菌漆酶来源广泛，产漆酶的真菌绝大多数为担子菌亚门（Basidiomycotina），约占80%，尤其是一些可以在自身生长过程中通过氧化和水解等作用降解天然木质素的白腐真菌，包括变色栓菌、木耳、香菇、云芝、糙皮侧耳等，其次是子囊菌亚门（Ascomycotina）（约占15%），极小部分为半知菌亚门（Deuteromycotina）和其他低等真菌（约占4%）[3-5]。1993年，AUDAN A等[6]在稻田土壤中发现分泌漆酶的细菌，经鉴定为脂固氮螺菌（Azospirillum lipoferum），ALEXANDRE G等[7]运用生物信息学技术，研究发现漆酶在原核生物中分布也较为广泛。除此之外，在少数昆虫（家蚕、果蝇、绿蝇、苍蝇、伏蝇）及一些动物内脏和血清中也发现了漆酶。不同来源的漆酶，作用、性质也各不相同，如漆树漆酶能够催化木质素聚合沉积，真菌漆酶能够催化木质素降解，而细菌漆酶在铜离子抗性和热稳定性等方面比真菌漆酶更具有优势[8-10]。

2 漆酶的结构与性质

不同来源的漆酶，在分子质量、氨基酸组成、铜原子数及类型等方面均有差异，但是大部分漆酶都具有三个典型的结构，即肽链、糖配基和铜原子[11]。真菌漆酶糖基化程度高，占酶分子的10%～49%，包括葡萄糖、半乳糖、氨基己糖、岩藻糖、阿拉伯糖等，糖基的组分和比例差异会产生同工酶，糖基也有利于漆酶结构的热稳定性，漆酶单体通常包含3～10个糖基化位点，细菌漆酶不需要糖基化的修饰。漆酶通常以单体蛋白体的形式存在，漆酶的分子质量通常为60～80ku，酸性pH催化效率较高，适宜温度低的环境[12-13]。大多数的漆酶为一条多肽链组成的单聚体，酶分子多肽链上大约含有500个氨基酸，主要含有19种氨基酸：Asp、Thr、Glu、Ser、Pro、Gly、Ala、Val、Cys、Met、Ile、Leu、Tyr、Gln、Phe、Lys、His、Arg、Trp[14]。

漆酶分子通常有4个铜原子，位于3个高度保守的不同结合位点，能催化O2通过4个电子还原成水，并氧化酚类和芳香类物质脱去羟基上的电子或质子，生成苯醌[15]。但也有特殊情况，如双孢蘑菇（Agaricus bisporus）分泌的酶分子只有2个铜原子，纯化后的蛋白卵白为淡黄色，射脉侧菌（Phlebia radiata）分泌的酶分子只含有2个铜原子，纯化后的蛋白为白色，而含有2个铜原子的漆酶为蓝色蛋白[16]。漆酶中的4个铜离子可分成三类：Ⅰ型Cu2＋和Ⅱ型Cu2＋各有一个，Ⅲ型Cu2＋两个，Ⅰ型Cu2＋又称蓝色Cu2＋，Ⅱ型Cu2＋不呈蓝色，Ⅰ型Cu2＋和Ⅱ型Cu2＋都是单电子受体，具有电子顺磁共振效应（electronparamagnetic resonance，EPR），Ⅲ型Cu2＋是双电子受体，不具有EPR性质[17]。

影响漆酶活性的因素包括温度、pH和金属离子等。漆酶的最适反应温度在25～85℃之间，大部分漆酶在50～60℃仍能保持稳定，不同来源的漆酶及其反应底物的不同会造成最适温度的不同。漆酶的最适pH范围为4～6，酸性pH时漆酶的催化活性更高。有些金属离子能够促进酶促反应，如铜离子；而有些金属离子却能够抑制酶促反应，如铜离子螯合剂。

3 漆酶在酿酒工业中的应用

啤酒和葡萄酒中含有多酚类物质，多酚不利于酒的稳定性，应尽可能除去[18]，漆酶可以氧化多酚物质，防止酒产生浑浊，进而改善酒的感官品质、延长保质期。

3.1 在保持啤酒性稳定性中的应用

透明度是衡量啤酒质量的标准之一，啤酒在灌装时呈澄清状态，在贮存过程中会产生浑浊，原因是贮藏时多酚与蛋白质复合产生大分子的多酚-蛋白质复合物，其中影响稳定性的多酚类物质主要是花色素原和聚合单宁[19]。聚乙烯聚吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVPP）可以与啤酒中的多酚物质形成不溶的络合物，但后续除去聚乙烯聚吡咯烷酮工艺较复杂。因此，采用漆酶是种较好的新方法。

用漆酶预先处理麦汁，可除去其中的多酚物质，减少了与蛋白质结合的前体物质，提高了啤酒的质量与清亮程度。PETERSENBR等[20]研究发现，在啤酒中加入适量漆酶，可以有效去除残留的O2，提高了啤酒的稳定性，漆酶和多酚反应产生的复合物可以采用离心等方法除去。ROSSI M等[21]研究发现，漆酶在啤酒的稳定性方面有重要作用。

3.2 在葡萄酒澄清中的应用

葡萄中含有的营养成分包括糖、花色素、多酚、有机酸、维生素等，葡萄酒是以葡萄为原料发酵而成的饮品，既保留了葡萄的营养成分，又在酿造过程中产生了新的营养成分，如醇类、酯类、酵母自溶物等[22-23]。葡萄酒中含有大量的酚类化合物，如单宁、花色苷、酚酸和黄酮醇等，酚类物质严重影响了葡萄酒的风味、颜色和稳定性[24]。

葡萄酒浑浊的主要原因包括蛋白质类浑浊、果胶类浑浊[25]。其中蛋白质类浑浊是由于蛋白质与葡萄酒中的单宁等多酚类物质复合形成不溶性复合物，导致葡萄酒变浑。生产中常通过添加PVPP、二氧化硫等除去多酚类物质[26-27]。但上述添加剂可能会降低酒的感官品质，有些还难以分解，造成环境污染。而漆酶可以氧化多酚类化合物，二者结合后，采用离心等方法除去。

CZYZOWSKA A等[28]研究发现，葡萄酒长时间储存后，多酚类物质的含量会减少，进而改变葡萄酒的色泽。CANTARELLI C等[29]研究发现，来自Polyporus versicolor的漆酶可以清除样品中70%的儿茶酚、90%的阿魏酸和90%的花色素，黑色葡萄汁经过漆酶的处理可清除50%的总多酚，通过和常规澄清方法对比，实验结果显示先用漆酶，再用硅藻土溶液或者聚乙烯吡咯烷酮处理葡萄酒溶液，更能有效提高葡萄酒的稳定性与感官品质，通过对比漆酶、酚酶、单宁酸酶和花色苷酶处理葡萄酒的效果，结果表明漆酶对酚类物质的清除率最高。MINUSSI R C等[30]采用来自Trametes versicolor的漆酶分别处理红葡萄酒和白葡萄酒，结果发现漆酶会清除红葡萄酒中具有抗氧化活性的多酚类化合物，而对白葡萄酒处理时，总酚类物质的减少对品质的有利作用高于抗氧化特性对品质的有利影响，因此可以用漆酶处理白葡萄酒。CONRAD L S等[31]采用酚氧化酶处理软木，优选的酚氧化酶是漆酶、过氧化物酶、儿茶酚氧化酶、邻氨基苯酚氧化酶，酚氧化酶的处理减轻了瓶装葡萄酒的特征性软木涩味。

目前，漆酶通常以固定化形式在葡萄酒的酿造中应用，但是必须保证它最终从葡萄酒中除去。

3.3 测定葡萄酒中的化学成分

CHAWLA S等[32]通过将漆酶以共价键形式固定化在金电极上的银纳米粒子（Ag nanoparticle，AgNP）/氧化锌纳米粒子（Zn nanoparticle，ZnONP）的纳米复合材料上，构建了一种采用高度敏感电流型生物传感器测量葡萄酒中总酚含量的方法，具有工作电位低（0.22 V），响应时间短（8 s），灵敏度高，和储存稳定性高（5个月）的优点。GAROIAGUZMHNJ J等[33]将漆酶生物传感器用于葡萄酒中酚类的选择性测定，主要响应邻二酚，通过对14种红葡萄酒和白葡萄酒进行取样，并对其进行生物传感器多酚指数（biosensor polyphenol index，I-BP）与二氧化硫（SO2）浓度的比率分析，以此来判断葡萄酒的营养价值。GODOY-NAVAJAS J等[34]研究发现了一种漆酶、氧化铽纳米颗粒（Tb4O7nanoparticles，Tb4O7NPs）和8-羟基苯乙烯-3-磺酸盐三钠（8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonicacid，trisodiumsalt，HPTS）结合的传感器，能够有效自动测定葡萄酒中多酚的含量，将该方法应用于几种葡萄酒样品的分析，获得了80.0%～108.3%的回收率。WANG Y等[35]建立了以咖啡酸和没食子酸为标准物的漆酶生物传感器，并分别对红葡萄酒、桃红葡萄酒和白葡萄酒中的多酚物质含量进行了测定，发现三种葡萄酒中的多酚物质含量从大到小依次为红葡萄酒、桃红葡萄酒和白葡萄酒，且咖啡酸比没食子酸表现出更高的灵敏度，通过漆酶生物传感器测定的总抗氧化活性与生物电化学多酚指数的线性关系可以计算葡萄酒的Trolox当量抗氧化能力（trolox-equivalent antioxidant capacity assay，TEAC）。但目前漆酶生物传感器稳定性较差、寿命较短，高效漆酶固定方法的使用、高催化性能材料的开发以及与微电子技术的联用将会使漆酶生物传感器在食品检测方面发挥更重要的作用。

3.4 作为葡萄汁中灰葡萄孢感染的指示剂

灰葡萄孢（Botrytiscinerea）分泌的漆酶能使葡萄腐烂，若葡萄被灰葡萄孢真菌感染，则在葡萄酒中会检测到漆酶的活性[36]。但MACHEIX J J等[37]研究发现，漆酶只能作为定性指示剂，暂时还不能定量分析出葡萄的受污染程度。在葡萄酒中检测出漆酶活性也只能确定葡萄被灰葡萄孢菌感染，而葡萄酒中漆酶的酶活与葡萄受污染程度还没找到比例关系，通过葡萄酒中漆酶的活力推测出灰葡萄孢菌感染程度对葡萄酒品质的控制以及其他食品、医药等领域的研究将具有不可忽视的作用。

4 展望

本文综述了漆酶的来源与分布、结构、性质以及其在酿酒工业的应用研究进展，包括在保持啤酒稳定性、葡萄酒澄清、测定葡萄酒中某些化合物、作为葡萄孢灰霉感染指示剂等方面。漆酶来源广泛，应用范围广，反应条件温和，无毒副产物。然而，目前有关漆酶的研究仍存在以下问题：漆酶在原始微生物中含量低，生产成本较高，工业产量低，尚不能进行大规模工业化生产[38]；此外天然漆酶的部分性质不适合工业上实际生产的需要，如最适温度、pH等；漆酶的分子结构、催化机理、异源表达和分子调控等方面有待深入研究。

今后对漆酶的深入研究，可以从以下几个方面进行：第一，筛选高产漆酶的菌株，采用生物学技术克隆酶学性质优良的新型漆酶基因，并对其进行异源高效表达和蛋白质工程改造；第二，探索适宜的培养条件，降低工业生产价格，增加漆酶产量；第三，优化漆酶的固定化方法，寻求或构建某种合适的固定化载体，增强漆酶的稳定性和使用效果；第四，拓展漆酶的应用范围以及技术参数和效果分析。随着人们对漆酶的研究进一步深入，相信在不久的将来，漆酶在酿酒工业中的应用前景会越来越广阔。

[1]李平，易弋，邓春.漆酶的结构及其应用研究进展[J].中国酿造，2016，35（5）：10-15.

[2]靳蓉.漆酶的来源与分离纯化技术[J].中国生漆，2012，31（3）：7-14.

[3]GIARDINA P,SANNIA G.Laccases:old future enzymes with a promising[J].Cell Mol Life Sci,2015,72(5):855-856.

[4]张跻.Coriolusversicolor产漆酶及其在染料脱色中的应用[D].杭州：浙江大学，2007.

[5]曾璐漫.不同培养基成分对灵芝漆酶酶活的影响[J].食用菌，2015，37（3）：7-8.

[6]AUDAN A,EFFOSSE A,FAURE D,et al.Polyphenol oxidase inA-zospirillumlipoferumisolated from rice rhizosphere:Evidence for laccase activity in non-motile strains ofAzospirillum lipoferum[J].Fems Microbiol Lett,2010,108(2):205-210.

[7]ALEXANDRE G,ZHULIN I B.Laccases are widespread in bacteria[J]. Trends Biotechnol,2000,18(2):41-42.

[8]王茂成，李勇，李世忠，等.木质素降解真菌的分离与相关酶活性测定及产酶条件优化[J].西南师范大学学报：自然科学版，2013，38（11）：122-126.

[9]王祎宁，赵国柱，谢响明，等.漆酶及其应用的研究进展[J].生物技术通报，2009（5）：35-38.

[10]鲁伦慧.农业废物堆肥中木质素降解功能微生物群落结构研究[D].长沙：湖南大学，2014.

[11]靳蓉，张飞龙.漆酶的结构与催化反应机理[J].中国生漆，2012，31（4）：6-16.

[12]李光日，余惠生，付时雨，等.漆酶催化活性中心结构及应用的研究进展[J].纤维素科学与技术，2000，8（2）：42-49.

[13]郑旭翰.漆酶在介孔材料上的固定化及性能研究[D].哈尔滨：哈尔滨工业大学，2006：34-56.

[14]雷福厚，蓝虹云.漆树漆酶和真菌漆酶的异同研究[J].中国生漆，2003，22（01）：4-8.

[15]赵敏，杨谦，宋小双，等.真菌漆酶分子生物学研究进展[J].林产化学与工业，2005，25（1）：115-120.

[16]谌斌.粗糙脉孢菌漆酶基因的克隆、定点诱变及其在毕赤酵母中的表达[D].无锡：江南大学，2006.

[17]张敏，肖亚中，龚为民.真菌漆酶的结构与功能[J].生物学杂志，2003，20（5）：6-8.

[18]张祥龙，金赞敏，石英.不同冷浸渍时间对葡萄酒中非花色苷酚的影响[J].中外葡萄与葡萄酒，2013（2）：21-26.

[19]张曼，王岸娜，吴立根，等.蛋白质、多糖和多酚间相互作用及研究方法[J].粮食与油脂，2015，28（4）：42-46.

[20]PETERSEN B R,MATHIASEN T E,PEELEN B,et al.Use laccase for deoxygenation of oil-containing product such salad dressing:WO, 9635768A1[P].1996-9-17.

[21]ROSSI M,GIOVANELLI G,BRENNA O.Effects of lactase and other enzymes on barleywort phenolics as a possible treatment to prevent haze in beer[J].B Liaison-Groupe Polyphenol,1988,14:85-88.

[22]李礼，陈尚武，张文，等.不同天然香料物质对蜂蜜酒发酵及品质的影响[J].中国酿造，2005，24（8）：11-13.

[23]孔硕，余铭，袁唯.酶制剂在啤酒品质改良中的应用[J].中国食品添加剂，2012（S1）：178-181.

[24]邵志芳.葡萄酒品质分析方法研究进展[J].中国酿造，2015，34（4）：17-20.

[25]王洪，罗惠波，黄治国，等.我国配制酒沉淀形成原因及处理方法研究进展[J].中国酿造，2016，35（8）：9-12.

[26]徐春.葡萄酒澄清技术的研究[D].南京：南京农业大学，2005.

[27]南景日.多酚类物质对啤酒质量的影响[J].农业工程，2013，3（3）：79-82.

[28]CZYZOWSKA A,KLEWICKA E,POGORZELSKI E,et al.Polyphenols,vitamin C and antioxidant activity in wines fromRosa caninaL. andRosa rugosaThunb.[J].J Food Compos Anal,2015,39(9):62-68.

[29]CANTARELLI C,BRENNA O,GIOVANELLI G,et al.Beverage stabilization through enzymatic removal of phenolics[J].Food Biotechnol, 1989,3(2):203-213.

[30]MINUSSI R C,PASTORE G M,DURAN N.Phenol removal and stabilization of red wine in the presence of laccase from Trametes versicolor [C]//Braziilian meeting of the chemistry of Food and Beverages,Sao Carlos-Brazil,1998.

[31]CONRAD L S,SPONHOLZ W R,BERKER O.Treatment of cork with a phenol oxidizing enzyme:U.S.6152966[P].2000-11-28.

[32]CHAWLA S,RAWAL R,KUMAR D,et al.Amperometric determination of total phenolic content in wine by laccase immobilized onto silver nanoparticles/zinc oxide nanoparticles modified gold electrode[J].Anal Biochem,2012,430(1):16-23.

[33]GAROIA-GUZMHN J J,HERNHNDEZ-ARTIGA M P,DE LEON L P P,et al.Selective methods for polyphenols and sulphur dioxide determination in wines[J].Food Chem,2015,182:47-54.

[34]GODOY-NAVAJAS J,AGUILAR-CABALLOSM P,GOMEZ-HENS A.Automatic determination of polyphenols in wines using laccase and terbium oxide nanopaticles[J].Food Chem,2015,166:29-34.

[35]QU J Y,LOU T F,WANG Y,YING DONG,et al.Determination of catechol by a novel laccase biosensor based on zinc-oxide sol-gel[J].Anal Lett,2015,48(12):1842-1853.

[36]单丽君，郑晓冬.漆酶在食品工业的应用进展[J].食品科学，2004，25（Z1）：190-194.

[37]MACHEIX J J,SAPIS J C,FLEURIET A.Phenolic compounds and polyphenoloxidases in relation to browning in grapes and wines[J].Crit Rev Food Sci Nutr,1991,30(4):441-486.

[38]刘家扬，焦国宝，有小娟，等.真菌漆酶的性质、生产及应用研究进展[J].生物技术通报，2016，32（4）：24-33.

Research progress and application of laccase in alcoholic drink industry

CHANG Chen,LIANG Min,BAO Yihong*
(College of Forestry,Northeast Forestry University,Harbin 150040,China)

Laccase is a copper-containing polyphenol oxidase,being widely researched and used in papermaking,biological bleaching,food industry and other areas.The source and distribution,structure and property of laccase and research progress of its application in alcoholic drink industry were summarized,including the stability of beer,the clarification of wine,the determination of certain compounds in wine,as the indicator ofBotrytis cinereainfection,and the development prospect of laccase in the alcoholic drink industry was prospected.

laccase;alcoholic drink industry;applications;research progress

Q554

0254-5071（2017）07-0018-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.07.005

2017-04-19

中央高校基本科研业务费专项资金项目（2572016CG02）；东北林业大学博士研究生自主创新基金项目（2572017AA02）

常晨（1994-），女，博士研究生，研究方向为林下资源精深加工，功能性食品。

*通讯作者：包怡红（1970-），女，教授，博士，研究方向为林下资源精深加工，功能性食品。