稳定同位素质谱在酿造调味品真伪鉴别中的应用进展

王奇，熊岑*，苏志义，刘钟栋，杨国武

（1.河南工业大学粮油食品学院，河南郑州450001；2.深圳市计量质量检测研究院，广东深圳518000；3.广东石油化工学院，广东茂名525000）

稳定同位素质谱在酿造调味品真伪鉴别中的应用进展

王奇1，熊岑2，3*，苏志义2，刘钟栋1，杨国武2

（1.河南工业大学粮油食品学院，河南郑州450001；2.深圳市计量质量检测研究院，广东深圳518000；3.广东石油化工学院，广东茂名525000）

稳定同位素质谱技术（IRMS）作为一种新的检测手段，近年来已经较多地应用于食品质量、真实性鉴定和掺假等研究中。该文简述了稳定同位素质谱技术的发展及检测原理，重点论述近年来该技术在食醋和酱油酿造调味品的掺假及真实性鉴定等方面的研究和应用进展，并对其在食品质量与安全方面的应用研究进行了展望。

稳定同位素质谱技术；掺伪检测；真实性鉴定；酿造调味品

科学和健康饮食是人们共同追求的目标，近些年来，在利益的驱动下的食品掺假现象不但侵犯了消费者的权益，更有可能威胁到消费者的身体健康。作为人们常用的酿造调味品，食醋和酱油掺伪情况也是屡见不鲜。食醋的主要成分为醋酸，还含有糖、乳酸、氨基酸和醇酯类等物质。食醋的掺假问题主要是工业醋酸的非法添加和名优食醋的冒充。酱油是以富含蛋白质和淀粉的粮食作物（如大豆等）经微生物发酵制成的调味液。酿造酱油中可能掺入酸水解蛋白调味液增加利润。对于食醋和酱油等传统酿造调味品掺伪检测，传统的食品理化检验方法已不能满足市场的需要，所以迫切需要研究检验食品安全的新方法和新技术，为食品安全提供有力保障。

稳定同位素质谱技术（stable isotope ratio mass spectrometry，IRMS）在国外较早的应用在葡萄酒的掺伪鉴别和年份区分检测中[1-3]。随着稳定同位素质谱技术的发展，在动物和植物类农产品真伪检测和产地溯源方面的应用逐渐增多[4]，如利用碳同位素比值可以鉴别蜂蜜中掺入蔗糖和糖浆的情况[5-6]，果汁是否掺入外源性的柠檬酸、葡萄糖、果糖[7-9]，肉类等掺伪鉴别和溯源等[10-11]。近年来，该技术已逐渐应用在食醋、酱油等酿造调味品方面的真伪鉴别中。本文主要阐述了基于稳定同位素质谱技术的检测方法在酿造调味品真伪鉴别方面的应用，并对其应用前景进行展望，以期为同位素质谱技术未来在更多的复杂加工食品方面上的应用研究提供参考。

1 稳定同位素质谱技术测定原理

同位素可分为放射性同位素（radioactive isotope）和稳定同位素（stable isotope）两大类。无可测放射性的同位素是稳定同位素，其中一部分是放射性同位素衰变的最终稳定产物，如206Pb和87Sr等；另一大部分是天然的稳定同位素，即自核合成以来就保持稳定的同位素，如12C和13C、18O和16O等。在物质的天然或人工合成中，会存在同位素分馏效应，使得产物具有相应的同位素比值。这些比值会受到地理位置、环境气候等诸多因素的影响[12]。同位素质谱的测定原理是：样品经过燃烧炉在高温下转化成气体，然后气体分子在离子源中被离子化，带电离子因质量不同在磁场作用下实现分离，最后法拉第收集器对具有特定质量的离子束强度进行测量。IRMS测定的是相对同位素比值δ，即将同位素比值（样品中某一元素的重同位素原子丰度与轻同位素原子丰度之比，如碳同位素比13C/12C、氧同位素比18O/16O、氮同位素比15N/14N、氢同位素比D/H等[13]）与标准物质同位素比值比较计算得到。

物源示踪研究结果显示，自然产物中的同位素组成差异非常小，对于植物而言，对其位素分布影响较大的是光合作用[14]。已发现的植物碳素转化的三种途径：C-3途径，C-4途径和景天科酸代谢途径（crassulaceanacidmetabolism，CAM）途径，这使得相关植物的δ13C值产生一定差异，利用这个原理实现对比鉴别。C-3途径的植物的δ13C值在-33‰～-22‰范围，如水稻、小麦、棉花、大豆、甜菜、土豆等大多数植物；C-4途径的植物的δ13C值在-20‰～-10‰范围，如甘蔗、玉米、高粱、苋菜等；而CAM途径的δ13C值相对更宽[15]。基于上述原理，稳定同位素质谱技术与其他常用技术联用可实现对食品掺伪及真实性检测，主要有元素分析-同位素质谱技术（elemental analysis-isotope ratio mass spectrometry，EA-IRMS）、液相色谱-同位素质谱技术（liquid chromatog raphy-isotoperatiomassspectrometry，LC-IRMS）、气相色谱-同位素质谱技术（gas chromatography-isotope ratio mass spectrometry，GC-IRMS）、连续流稳定同位素质谱技术（GasBenchⅡ-IRMS）等。

2 稳定同位素质谱技术在酿造调味品中的应用

2.1 在食醋真伪鉴别中的应用

食醋生产的主要原料有：薯类（如马铃薯等）、粮谷类（如玉米、大米等）、粮食加工下脚料（如麸皮、谷糠等）等。对于食醋而言，不同产地、不同生产原料等因素使得C、H等元素的同位素比值有所差异。目前仅有国家标准GB/T 22099—2008《酿造醋酸与合成醋酸的鉴定方法》用于鉴定酿造醋酸与合成醋酸，该技术采用液体闪烁法测定比较14C值，合成醋酸中的14C会大量衰变，而酿造醋酸中14C含量则比较稳定[16]。但该法使用的为放射性同位素，可能会产生污染，而且由于仪器条件限制不易推广。此外，还有碘液法和高锰酸钾法等[17]，这些传统的检测方法，检测指标单一，参考依据较少，不能够满足实际生活中解决掺假问题的需要。基于此，近年来有许多基于光谱和色谱技术测定的元素、有机成分等多指标结合的数据模型综合判定方法[18-20]、指纹图谱法[21]等研究报道，较好地改善了鉴别方法的实用性。同位素质谱分析技术在国外近年来已用于食醋研究领域做了大量初步研究工作，可判断酿造食醋的植物来源是C3还是C4植物，区别食醋品种和掺假，也可以区别食醋中是否违规添加了工业醋酸。已报道的研究方法大多数是针对食醋中各种物质的碳同位素比率δ13C值来分析，可利用EA-IRMS对通过前处理提取的食醋中糖、蛋白以及分离出的沉淀物分别测定整体的碳同位素比率δ13C值；还可以结合GC-IRMS或LC-IRMS技术针对乙醇、乙酸以及其他有机酸的碳同位素比进行测定[22]。

由于食醋属于粮食加工产品，在酿造生产过程中发生的化学变化产生的元素分馏和各种额外添加剂的使用都会影响碳同位素比值。在利用同位素比值研究食醋真实性或溯源生产地的过程中，必须要考虑这些额外因素的影响，以免误判。李鑫等[23]通过测定食醋原料（大米）、添加剂（焦糖色）和食醋的碳同位素比率δ13C值，研究了食醋原料和生产工艺对食醋的影响，研究发现，原料大米的δ13C在-28‰～-24‰之间属于典型C3植物来源；原料焦糖色的δ13C在-12.5‰～-9.0‰之间，属于典型C4植物来源；而食醋产品的整体δ13C在-26‰～-23‰，略高于大米的δ13C值，但仍属于C3植物来源区域。这种波动说明食醋的碳同位素比值会受生产工艺和添加剂的影响，但从整体的食醋碳同位素比值无法判定同样使用大米为原料酿造的食醋品种。

而对于使用不同原料、且生产工艺区别较大的食醋品种，使用碳同位素值可以在一定程度上实现品种，甚至产地的区别。王修宁等[24]使用食醋的整体碳同位素比值对以葡萄汁为主要原料的芳香醋、以糯米为主要原料的糯米酿造食醋、以苹果为主要原料的苹果醋和配制食醋进行了区分。除了配制食醋外，其他几种酿造食醋的δ13C值都在C3植物来源区域，由于各种原料区别较大，因此其δ13C值范围有一定的区别，结合聚类分析法，可以对几种食醋进行区别。此外，结合聚类分析法，可以实现价格较贵的芳香醋中掺入价格相对低的食醋掺伪情况，可以鉴别出加入≥4%糯米酿造食醋、≥6%苹果醋和≥2%配制白醋的掺伪情况。

食醋中乙酸作为食醋的主要有机成分，其同位素比值差异必然反映了不同食醋之间的差异。使用GC-IRMS测定时，利用其中的气相色谱部分将食醋中乙酸分离出来，在燃烧转化中将乙酸转化为CO2，最后用同位素质谱部分测定乙酸的碳同位素比值。在样品前处理过程中，可以利用乙醇等有机溶剂直接稀释食醋样品再进行GC-IRMS分析，可以免去蒸馏前处理步骤[25-26]。邱皓璞等[27]通过测定镇江和山西两个国内产醋地区的代表性食醋—香醋和陈醋中的乙酸碳同位素比值，发现以采用大米为主要原料发酵酿制而成的香醋，δ13C值均＜-20‰，位于C3植物来源区域；而以高粱和玉米为主要原料酿造的陈醋均＞-15‰，属于C4植物来源区域。结果说明，可以利用乙酸的碳同位素比值区分食醋原料来源。

食醋的其他主要成分如乙醇、有机酸等物质的同位素比值也可以作为真伪鉴别指标。李鑫等[28]还利用液相色谱-同位素质谱联用技术（LC-IRMS）测定了食醋中乙醇的碳同位素比值，同时考察了食醋、食醋沉淀物和食醋中乙醇三者的碳同位素比值的关系，研究对比发现，食醋、工业酒精、玉米食用酒精、淀粉酒精、大米食用酒精和高粱食用酒精的乙醇δ13C在-31‰～-28‰范围内，只有大米食用酒精的值比较接近食醋中乙醇的碳同位素比值，可以通过乙醇的δ13C值来判定大米为原料的食醋是否额外加入其他酒精。李鑫等还利用LC-IRMS同时测定食醋中乙酸和乳酸，发现试剂乳酸（δ13C值-13.58‰～-9.86‰）和食醋中乳酸（δ13C值-31.75‰～-20.91‰）差别较大，可以应用到食醋掺伪中。但是，生产过程中葡萄糖的添加会增加乳酸的碳同位素比值，甚至可能是外源添加的柠檬酸。研究过程中发现，乙醇会干扰乳酸的测定，需要在前处理阶段通过加热到80℃挥发除去乙醇。由于该联用仪器液相部分不能使用有机相，所以需要选择能在纯水作为流动相下分离有机酸的色谱柱[29]。此外，有研究发现食醋中水的18O可以区分葡萄酒来源的醋和粮食醋以及水果醋[30]。

大多数研究表明，仅通过食醋中醋酸的碳同位素比值无法区分天然来源和添加有工业醋酸的食醋，而联合使用点特异性天然同位素分馏核磁共振技术（site-specificnatural isotope fractionation-nuclear magnetic resonance，SNIF-NMR）测定D/H比值可以实现区分[31]。SNIF-NMR可以确定同位素在分子中的具体位置，可以和IRMS联用获得更全面的信息[22]，但目前在我国普及有较大局限性。此外，有研究者通过测定食醋中水的D/H、13C/12C以及18O/16O同位素比值，可以对香醋的掺伪鉴别[32]。

同位素质谱技术研究食醋掺伪方法需要联合多种技术，需根据各方法特点进行样品和项目测试的合理选择。目前使用EA-IRMS对食醋这种液体样品测试时，由于EA采用的是锡纸包裹样品进样，测试液体样品时，样品量过小会影响信号强度，样品量过大易于溢出且燃烧不完全，进样量一般在1～2 μL。而LC-IRMS技术，则可以对样品中特定有机酸等物质进行测定，但是由于同位素质谱信号问题，微量的物质无法检测出信号，且物质定性不方便，需要在前处理过程中排除可疑干扰[29]；GC-IRMS需要结合样品富集技术才可以测得更丰富的物质，目前报道大多数测定含量较大的乙酸和乙醇中同位素比值。但是，还需要考察各个环节分流对碳同位素质谱的影响，如前处理蒸馏和萃取过程、溶剂稀释等过程[25]。

2.2 在酱油真伪鉴别中的应用

酱油是一种常用的调味品，以大豆等粮食作物经微生物发酵制得，种类可分为酿造酱油和配制酱油两种。酱油的使用不但能改善食物色泽，还能增加食欲。酱油的主要成分是钠盐，还有部分的蛋白质和碳水化合物。目前针对酱油的检测方法有气相色谱法、液相色谱法、液-质联用等[33]，这些都是针对酱油中特定成分的检测，无法实现掺伪的检测。

谭梦茹等[34]针对酿造酱油中可能掺入酸水解蛋白调味液进行研究，采用EA-IRMS分别对酱油整体、酱油中分离出的糖和氨基酸测定其δ13C值，用Ca（OH）2沉淀氨基酸，沉淀后的上清液用来测定糖。测定结果与酸水解调味液对比后，提出酿造酱油应满足氨基酸δ13C值≤-21.50‰，对于在试验样本中氨基酸δ13C值＞-21.50‰的进一步采用GC-IRMS测定了乙酰丙酸，确证该类样本掺入了C4来源的酸水解蛋白调味液。目前同位素质谱技术在酱油产品上的研究还很少，未来在酱油掺假和产地溯源还有较大的研究拓展空间。

3 结论与展望

本研究论述了近年来稳定同位素质谱技术在食醋和酱油酿造调味品的真伪鉴别方面的研究和应用进展。食醋、酱油等酿造调味品目前检测的对象主要是醋酸、乙醇、氨基酸等含量较多的物质，其他成分也有待进一步研究。在掺伪的鉴别方面，单一指标也无法实现准确判断。实验过程中是否因同位素分馏影响结果以及实验方法的有效确证，这些都是努力的方向。关于这类复杂产品的真实性和掺伪鉴别，同位素质谱技术未来还需结合多方研究数据，在大规模的样本支撑下，对实验结果进行统计分析，得出准确有效的评判依据。

国内的同位素质谱技术也正处在不断发展中，在食品掺假和产地溯源方面，基于天然同位素分馏现象，它能够实现常规检测方法无法达到的有效检测。稳定同位素质谱技术更多的是依托系统的研究和数据库的建立，来保证结果的准确性和可靠性。国外已建立葡萄酒数据库，但这对于国内却并不完全适用。同位素质谱技术发展前景广阔，在未来随着数据库的建立和检测标准的形成，使其能够真正准确、有效地应用到保障食品安全上。

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Application progress of stable-isotope ratio mass spectrometry in the authenticity identification of brewing condiments

WANG Qi1,XIONG Cen2,3*,SU Zhiyi2,LIU Zhongdong1,YANG Guowu2
(1.College of Food Science and Technology,Henan University of Technology,Zhengzhou 450001,China; 2.Shenzhen Academy of Metrology and Quality Inspection,Shenzhen 518000,China; 3.Guangdong University of Petrochemical Technology,Maoming 525000,China)

Stable-isotope ratio mass spectrometry technology(IRMS)as a new detection method has been widely used in the detection of food quality and authenticity identification in recent years.The development and detection principle of IRMS were described,and the research and application progress of the technology in authenticity identification of vinegar and soy sauce were systematically summarized.The application research of the technology in food quality and safety were also prospected.

stable-isotope ratio mass spectrometry;adulteration detection;authenticity identification;brewing condiments

TS264.22

0254-5071（2017）07-0014-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.07.004

2017-03-17

广东省科技厅广东省协同创新与平台环境建设专项（2016A040403075），国家重大科学仪器设备开发专项（2012YQ090167-0402）

王奇（1993-），男，硕士研究生，研究方向为食品掺伪鉴别、食品添加剂和配料。

*通讯作者：熊岑（1985-），女，高级工程师，博士，研究方向为食品分析及食品真伪鉴别。