基于蛋白质和DNA的食品过敏原检测技术的研究进展

丁亮，付琳，吴秀莲，李梦雪

（南京市质量技术监督局高淳区质量计量检测所，江苏南京211300）

基于蛋白质和DNA的食品过敏原检测技术的研究进展

丁亮，付琳，吴秀莲，李梦雪

（南京市质量技术监督局高淳区质量计量检测所，江苏南京211300）

目前，食品过敏问题已成为全球性的健康问题。在食品加工过程中产生的食品过敏成分或微量过敏原对敏感机体都是巨大的健康威胁。因此，可靠的分析方法是鉴别和检测食品中过敏成分所必需的。该文综述了基于蛋白质和脱氧核糖核酸(DNA)的食品过敏原检测技术的应用及发展，并展望了其未来发展趋势。

食品过敏原；蛋白质；脱氧核糖核酸；检测

食品过敏是致敏机体在再次受到食品中同种抗原刺激时引起的不良免疫反应。食品过敏反应通常由免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）介导，主要分为致敏和发敏两阶段。在机体初次受食品中抗原刺激后会产生抗原特异性IgE，并与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的Fc受体结合，使机体处于致敏状态。当机体再次接触同一食品抗原后，会在肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面通过交联抗原特异性IgE产生过敏反应，使得大量蛋白水解酶、白三烯或促炎细胞因子释放，引起过敏症状。致敏个体由于过敏原的摄入而产生的临床症状包括荨麻疹、瘙痒、水肿、支气管痉挛、鼻炎、呕吐、腹泻、痉挛，甚至致命的过敏性休克[1-2]。

目前，食品过敏被世界卫生组织纳入五个最重要的公共健康问题之一，特别是在工业国家，有2%成年人和4%～8%幼儿受其影响。由于不同地区饮食习惯的不同，食品过敏的发病率和患病率还在不断增加。在已确认的可引起过敏反应的160多种食物中，有8种被认为与90%食物过敏有关。这些“主要的食品过敏原”包括牛奶、蛋类、鱼、甲壳动物贝类、坚果、小麦、花生和大豆[3-4]。为保护消费者安全及向消费者提供更多信息，多国立法规定食品包装袋上需要标注过敏原。另一方面，提高现有食品过敏原的检测分析方法，并制定新的标准化方法，为食品和餐饮业提供适当的工具以及为“食品过敏”消费者提供“无过敏原”食品也是避免食物过敏重要的途径。本文对基于蛋白质和脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）的检测方法在食品过敏原检测中的应用进行了介绍，如免疫化学法、蛋白质组学方法、聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）等，及对食品过敏原检测方法的发展进行了探讨。

1 食品过敏原成分检测的靶目标分子

食品过敏原成分检测主要依赖于过敏原自身或过敏原成分的标记分子。通常有两类标记分子用于检测过敏原：过敏原成分中的特征性蛋白和能表征过敏成分的特定的DNA序列。由于蛋白靶标和DNA靶标各有利弊，因此应根据食品自身进行选择。一般选择某种靶分子的重要依据在于其在样品中的丰度，这将影响到检测方法的灵敏性。蛋白同源性也是重要参考因素，当选择某种蛋白作为靶分子检测不同物种中的过敏原时，应选择保守性较高的同源蛋白。尽管蛋白检测方法比较常用，但蛋白成分容易受到食品加工和外界变化的影响，如季节和地理的影响；热加工也会降低目的蛋白溶解度。而DNA分子则具有更好的稳定性，且不受表型变异影响，因此更有助于定量分析及用于对敏感性要求较高的场合。

在DNA靶标中，常用的靶向分子包括单拷贝或多拷贝分子，如线粒体、叶绿体或其他高度重复序列。由于多拷贝分子在样品中数量较多，其可提高分析敏感性，而单拷贝分子则因恒定的拷贝数而更适合定量分析。DNA靶标的选择也受公共数据库中DNA序列可利用度的影响。尽管可能缺少某些过敏成分的DNA序列，但随着高通量和低成本技术的发展（如下一代测序），越来越多可利用的序列正存储在公共数据库，这也有助于依赖DNA的过敏原检测技术的发展。

2 依赖蛋白质的过敏原检测技术

2.1 免疫化学法

传统上，食品过敏原主要用免疫方法检测，即利用抗体检测过敏原中的目标蛋白。目前以免疫化学为基础的食品过敏原检测方法主要有放射/酶联过敏原吸附抑制实验（radio-allergosorbent/enzyme allergosorbent inhibition test，RAST/EAST）法、火箭免疫电泳（rocketimmuno-electrophoresis，RIE）、酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）和斑点免疫印迹（dot immunoblotting）法等。其中，ELISA是食品工业中检测食品过敏原最常用的方法，其灵敏度好，操作方便[5-6]。ELISA中过敏原与特异性酶标记的抗体结合后，通过检测酶活性而产生比色反应来对过敏原进行定量或定性分析。目前，已有大量商品化的ELISA试剂盒可检测或定量复杂食品中的小麦、鸡蛋、花生、大豆、牛奶、杏仁、榛子、羽扇豆、芝麻、芥菜和荞麦等，检测限达0.1～20 mg/kg[7-9]。

RAST/EAST是一种竞争性IgE结合试验，即先将与人体特异IgE抗体结合的过敏原固定在固定相，样品中的过敏原则抑制固相上的过敏原与IgE结合，再通过显色反应检测结合的IgE，从而定量样品中的过敏原[10]。RAST/EAST多用于临床中食品过敏原诊断，其用于商业中过敏原定量检测主要受限于对过敏者血清的依赖性及实验的标准化。RIE则是用含有抗体的凝胶进行检测，过敏原根据自身的电泳迁移率进行迁移直到抗原-抗体复合物在凝胶中沉淀[11]。尽管RIE已被用于检测多种食品过敏原，但其未能被广泛应用的原因在于繁琐的凝胶制备过程及免疫染色程序。随后发展的侧流免疫层析法和试纸检测是ELISA试剂盒方法的进阶，主要在膜带上进行，然而其仅能用于蛋白定性检测[12]。还有其他较少用于食品过敏原检测的免疫化学方法，如斑点免疫印迹试验可用于检测牛奶乳清蛋白、花生、榛子和巴西坚果等[13]。

总体而言，免疫化学方法，特别是ELISA在检测食品过敏原时，灵敏性好，容易操作。然而，其也存在多种缺陷，如抗体的交叉反应，易产生假阳性；食品中其他成分的干扰；在固体基质的吸附可能破坏过敏原表位等。尽管如此，ELISA仍是食品过敏原鉴别和定量的重要方法。

2.2 蛋白质组学方法

蛋白质组学包括蛋白序列与改造、蛋白功能研究、蛋白间相互作用和定位以及蛋白丰度。由于蛋白质是食品多种特性的生物标记分子，蛋白质组学在食品科学研究中具有重要作用。样品的蛋白组学分析包括蛋白水平的多步分离和质谱分析。目前有2种蛋白组学分析流程：一是蛋白质先被酶水解后得到多肽，然后进行质谱分子；二是在质谱仪中直接将整个蛋白碎片化，避免了蛋白酶解过程[14]。在这两种方法中，通过将蛋白质和多肽的质谱实验数据与蛋白质数据库的数据进行对比，匹配最佳的蛋白即为目标蛋白。HEICK J等[15]利用液质联用多元反应监测方法同时鉴别及定量面粉和面包中多种食品过敏物，如花生、核桃、榛子、杏仁、鸡蛋和牛奶，检测限达3～70 mg/kg。基于蛋白质组学的食品过敏原检测方法克服了免疫学方法中交叉干扰的弊端，可对多种蛋白质和多肽进行测定，且可同时检测多种过敏原。蛋白质组学可确定过敏原的分子量、测定其翻译后修饰、鉴别过敏蛋白的新亚型。基于蛋白质组学的过敏原检测技术提高了食物链的安全性。目前该方法的应用需要相对先进的设备和计算基础设施，有大量数据产生，其应用依赖于高技能人员，这使得成本增加，有点超出大多常规分析的范畴。

3 依赖DNA的过敏原检测技术

3.1 终点定量PCR和PCR-ELISA

终点定量聚合酶链反应PCR（end point quantitative polymerase chain reaction，End-point quantitative PCR）是简单低成本的DNA扩增方法。其主要的缺点在于需要通过凝胶电泳检测扩增产物，由于凝胶电泳检测的灵敏度有限，使得该技术准确性降低。聚合酶链反应酶联免疫吸附测定（PCR-ELISA）中，用生物素或地高辛标记扩增的DNA片段作为抗原，通过与捕获探针杂交固定于固相捕获系统，随后通过酶标抗体实现显色定量分析。通过这种方式，PCR-ELISA可以用一组通用引物去检测和区分多个序列/目标，因此对检测多种致敏成分比较有优势。然而，这种方法只能算是半定量，因为该量化是在PCR反应结束后进行。HOLZHAUSER T等[16]在比较PCR-ELISA和ELISA检测榛子效果的研究中，发现两种方法敏感性类似，但PCR-ELISA具有更好的特异性。

3.2 qPCR

实时定量聚合酶链反应（real-time quantitative PCR，qPCR）可监测样本扩增的每时每刻各荧光值的连续变化。如今，qPCR已被广泛用于食品分析，包括过敏原成分分析。与终点定量PCR相比，qPCR具有明显优势，如可检测短片段，不需凝胶电泳检测等。在食品分析中，qPCR方法主要依赖于两种检测化学物质：DNA结合染料和水解探针。前者中最常用的是SYBRGreen染料，后者多为TaqMan探针。qPCR可以潜在的用于定量分析食品过敏成分，但目前大部分方法还是基于绝对定量，其主要依赖于标准曲线。COSTA J等[17]成功地利用qPCR在食品中检测出杏仁，且通过扩增杏仁中Pru du 5（也叫酸性核糖体蛋白P2）过敏原的编码序列从其相关产品中鉴别杏仁。INIESTO E等[18]研究了烘焙、高压和蒸汽灭菌处理对榛子过敏原编码序列的影响，结果表明，热处理、烘焙、蒸汽灭菌都可降低榛子DNA检测能力，这是由于DNA提取率和DNA完整性降低。由于某些食品的组成成分可能抑制PCR反应，其会影响qPCR对过敏成分的定量检测[19]。在DNA提取和纯化之前向食品中加入内标物将有助于提高定量结果的可信度，因为食品成分对DNA提取和纯化的影响可通过对内标物的影响估量。

3.3 高分辨熔解分析

高分辨率熔解度分析（high resolution melting analysis，HRM）是通过检测温度升高时PCR扩增产物逐渐熔解产生的荧光变化，分析样品中DNA产物[20]。随着高分辨率仪器和饱和荧光DNA结合染料的发展，HRM分析已被用于基因分型、表观遗传学、食品检测研究。因特定PCR产物的熔融温度（Tm）可用于在种属水平区分食品，HRM分析已被用于食品成分鉴定。COSTA J等[21]利用HRM结合实时PCR通过检测杏仁中的Pru du 5过敏蛋白编码基因从加工食品中检测到微量杏仁。MARTÍN-FERNÁNDEZ B等[22]利用HRM可将小麦与其他谷物（如大麦、黑麦和燕麦）区分开。加工食品产物中榛子也可被DNA条形码-HRM定量，检测限达0.01%[23]。

3.4 连接依赖探针扩增

连接依赖探针扩增（ligation-dependent probe amplification，LPA）是基于两个荧光标记的寡核苷酸片段探针，与靶序列DNA进行杂交，然后连接扩增，分析产物。仅当两个寡核苷酸探针分别与靶序列完全互补时，连接酶才能将两段探针连接成一条完整的核酸单链，随后产生特定大小的扩增产物，通过毛细管电泳鉴别[24]。LPA已用于检测10种不同的过敏成分[25]。在不同的矩阵测试时，LPA可鉴别单一过敏原，检测限达5 mg/kg。与内部阳性对照信号相比，8种过敏成分信号的检测限范围为5～400基因拷贝数[26]。

3.5 DNA arrays

为进行多重检测，许多芯片被用于检测PCR产品，并用于检测食品中的过敏成分。ROSSIS等[27]使用肽核酸（peptide nucleicacids，PNAs）芯片检测扩增的花生和榛子DNA。PNAs是结合到互补DNA序列的寡核苷酸类似物，较其同源DNA表现出更高的亲和力和特异性[28]。电化学DNA芯片可检测榛子中两个不同过敏原的特异性DNA片段，且样品浓度可在纳摩尔水平。WANG W等[29]在含硅的表面开发出一种光学薄膜微阵列方法，可在两个tetraplex PCR系统中同时检测8种食物过敏成分，如同时检测腰果、花生、小麦、大豆、鱼、鸡、虾和牛肉，及同时检测芝麻、燕麦、杏仁、芹菜、榛子、核桃、羽扇豆和芥末[30]。此时，信号可肉眼观察而不需额外的仪器。从榛子、花生和大豆DNA扩增的地高辛标记的PCR产物，可利用5′-生物素探针杂交检测，该探针可被链霉亲和素修饰的数字化视频光盘（digital video disk，DVD）表面固定，检测限达1 μg/g[31]。基于5′-SH和3′-生物素标记茎环双探针的电化学DNA传感器，也可通过检测Ara h 1基因的片段来检测花生是否存在，检测限为0.35 fmol/L，线性响应范围10-15～10-10mol/L。DNA传感器可在未进行PCR扩增的情况下定量检测花生乳饮料的DNA提取物[32]。

4 结束语

如今，为了保护过敏机体免受过敏原反应的困扰，人们提倡减少接触任何过敏原的机会。但由于加工食品通常还有各种各样的成分，包括潜在的过敏原，使得很难完全不接触过敏原。因此，食品过敏原的检测是当前食品安全的重要任务。由于依赖蛋白质检测方法的复用能力及质谱仪器的新发展，蛋白质组学方法正被广泛替代传统的免疫化学方法和基于DNA的PCR法。同样的，多种DNA检测新技术正蓬勃发展，如HRM、LPA和DNA芯片。除上述几种方法外，寡合苷酸适体，即结合多种目标物的单链或RNA寡核苷酸，也逐步作为抗体的另一选择应用于生物分析，目前已有多种适体用于食品过敏原的检测；生物传感器，特别是新型纳米材料，也逐步用于检测食品过敏原。

在食品中的过敏成分检测中，为得到可靠的具有可比性的分析结果，还需要验证及协调各分析方法。同样地，对于新开发的快速检测方法，如基于生物传感器的方法，也需要进行验证，及评估其真实食品样品中的适用性。

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Recent advance of detection technology of food allergens based on protein and DNA

DING Liang,FU Lin,WU Xiulian,LI Mengxue
(Gaochun Testing Institute of Quality and Metrology,Nanjing Bureau of Quality and Technical Supervision,Nanjing 211300,China)

At present,food allergies have become global health concern.The food allergenic ingredients or micro-allergens produced during food processing were a huge health threat on sensitive individuals.Therefore,the reliable analytical methods are necessary to identify and detect allergenic ingredients in food.The application and development of food allergen detection technology based on protein and deoxyribonucleic acid(DNA)were summarized,and the future development trend was prospected.

food allergens;protein;deoxyribonucleic acid;detection

TS207.3

0254-5071（2017）07-0157-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.07.034

2017-05-10

丁亮（1988-），男，助理工程师，本科，研究方向为食品检测。