加味丹参饮含药血清对hVEGF165转染BMSCs促IRI大鼠心肌血管新生的影响

杨洋，黄政德，阮甦，梁晖，严年文，林昱，高千仞

（1.福建中医药大学附属人民医院，福建福州350004；2.湖南中医药大学，湖南长沙410007）

加味丹参饮含药血清对hVEGF165转染BMSCs促IRI大鼠心肌血管新生的影响

杨洋1，黄政德2，阮甦1，梁晖1，严年文1，林昱1，高千仞1

（1.福建中医药大学附属人民医院，福建福州350004；2.湖南中医药大学，湖南长沙410007）

目的探讨加味丹参饮含药血清诱导血管内皮生长因子165（hVEGF165）转染后BMSCs移植IRI大鼠的心肌血管新生的影响。方法构建hVEGF165转染BMSCs，将hVEGF165转染后PIII／IV BMSCs分别加入加味丹参饮含药血清和空白血清，体外诱导48 h。建立IRI大鼠模型，将实验大鼠分为4组，A组：假手术组；B组：IRI组；C组：hVEGF165转染组；D组：hVEGF165转染+加味丹参饮含药血清组。移植第7天，HE染色观察心肌组织形态学变化并做微血管计数。结果移植7 d后，与A组相比，B组心肌微血管有一定再生，C组及D组与B组相比，微血管数上升明显，差异具有统计学意义（P＜0.05）；D组与C组相比，微血管数上升，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论IRI大鼠模型在移植hVEGF165转染BMSCs后，新生血管增多，加味丹参饮含药血清和hVEGF165转染联合应用效果更佳。

加味丹参饮；骨髓间充质干细胞；hVEGF165；基因转染；心肌缺血再灌损伤；血管新生

骨髓间充质干细胞（BMSCs）有取材方便、可来源于自身、免疫原性较低、在体外增殖能力强、并不涉及伦理学问题的特点，目前已作为一种重要的种子细胞，引起研究人员的广泛关注［1］。BMSCs可以在适当的诱导条件下分化为心肌细胞、血管内皮细胞、神经细胞、上皮细胞和脂肪细胞以及骨骼、骨髓基质、肌腱、关节和肌肉等多种组织［2］，成为目前心血管领域的研究热点。

大量实验研究证明：中药对干细胞的增值、定向分化有调控作用［3］。在黄芪、丹参等中药对BMSCs的分化影响研究中发现：黄芪、丹参含药血清对BMSCs的增殖具有促进作用［4］。有研究表明黄芪甲苷具有诱导BMSCs分化为心肌样细胞的作用［5］。本实验在前期研究［6］基础上，以hVEGF165基因转染BMSCs为切入点，建立大鼠心肌IRI模型，通过加味丹参饮含药血清体外诱导hVEGF165基因转染后BMSCs移植大鼠心肌IRI模型，观察移植后第7天大鼠心肌血管新生的影响。

1 材料

1.1 实验动物及移植细胞SPF级SD大鼠，雌雄各半，平均体质量在（220±20）g，平均周龄12～14周，共80只，由湖南中医药大学动物实验中心提供，动物许可证：SCXK（湘）2009-0004，实验过程符合动物伦理学要求［7］。移植用hVEGF165转染BMSCs：将携有血管内皮生长因子165基因的质粒pGLVEF1a，采用慢病毒转染BMSCs。

1.2 加味丹参饮灌胃液制备本方是黄政德教授运用“行气活血”之法治疗胸痹心痛的有效经验方，由丹参、赤芍、檀香、川芎、当归等组成，草药由湖南中医药大学第一附属医院药房提供。除檀香外，其它药材加双蒸水3 000 mL浸泡30 min，回流提取2 h，滤出药液；再加双蒸水2 L，回流提取90 min；檀香分两等份分别于两次提取结束前15 min加入；合并两次药液，水浴浓缩至500 mL，3 500 rpm，离心10 min，取上清液；继续浓缩至生药浓度为1 g/mL，共250 mL，4℃条件下保存备用。

1.3 主要仪器AIR TECH超净台（苏州净化集团有限公司）；AX-ⅡX射线摄影暗室（广东粤华医疗器械厂有限公司）；倒置荧光显微镜（奥林巴斯株式会社）；切片机（湖北泰康医疗设备有限公司）；大鼠心电图机（江苏玉研科仪器有限公司）；小动物呼吸机（江苏玉研科仪器有限公司）。

1.4 溶液配制含药血清制备：SD大鼠平均体质量（270±10）g，雌雄各半，平均周龄12～14周，共30只。参照《药理实验方法学》［8］，按照动物与人体的每公斤体重剂量折算系数表，成人与大鼠折算系数为6.25。按60 kg成人每天服用加味丹参饮60 g计算，大鼠临床等效计量为60 g/60 kg×6.25＝6.25 g/kg。加味丹参饮灌胃液，按照6.25 g/kg，2次/d，连续5 d对SD大鼠进行灌胃。腹主动脉取血，3 000 rpm，10 min离心后吸出上部血清，得到加味丹参饮含药血清，于-20℃冰箱中保存备用。空白血清制备：等数量SD大鼠灌胃等剂量生理盐水，2次/d，连续5 d。制备及保存方法同含药血清。

2 方法

2.1 心肌缺血再灌注损伤模型建立符合要求SD大鼠，10%水合氯醛麻醉固定，接心电图，剪去左侧胸部3～6肋区域和颈部毛，碘伏消毒铺单；剪刀剪开颈部皮肤，钝性分离肌肉组织，暴露气管，行气管插管术，接呼吸机；剪刀剪开左侧胸部皮肤，手术刀片于四五肋间沿肋间隙切开肌肉，开胸器开胸暴露心脏，钝性分离心包，暴露心脏，在左冠状动脉前降支伴行静脉旁进针2 mm，将静脉及伴行左冠状动脉前降支共同结扎。造模成功标志：左冠状动脉前降支供血区心肌苍白，心脏搏动减弱，心电图显示肢体导联R波振幅明显升高，I导联和aVL导联J点明显抬高。结扎15 min后松线，造成IRI模型。

2.2 III/IV代hVEGF165转染BMSCs制备及动物分组采用全骨髓贴壁法，雌雄各半，平均体质量（50±10）g，平均周龄3～4周，共20只SD大鼠。处死后无菌条件下取出胫骨和股骨，暴露骨髓腔，L-DMEM液反复冲洗骨髓腔。冲洗液，1 500 r/min，离心5 min，弃上清液，加入含有15%胎牛血清的完全培养液，制成单细胞悬液按1×108个/mL密度接种于50 cm2培养瓶中，在37℃、饱和湿度、5%的CO2培养箱中培养，当细胞生长融合基本达到80%～90%时进行传代。取生长融合70%～80%的III/IV代hVEGF165转染BMSCs备用。造模成功SD大鼠随机分组，每组10只（死亡大鼠剔除，手术组均予结扎30 min后实施干预），A组：假手术组，只穿线，不结扎；B组：IRI组；C组：在IRI模型成功后，进行hVEGF165转染BMSCs移植；D组：在IRI模型成功后，进行加味丹参饮含药血清诱导的hVEGF165转染BMSCs移植。

2.3 加味丹参饮含药血清最佳工作浓度采用前期研究得出促进BMSCs分泌VEGF最佳浓度的40%加味丹参饮含药血清为本实验的工作浓度［9］，取hVEGF165转染PIII/IV代BMSCs，体外诱导48 h后，收集细胞，调整细胞密度，进行细胞移植。

2.4 移植及给药方法

2.4.1 注射位置的确定造模后，缺血心肌苍白搏动减弱，与正常心肌细胞的鲜红色形成对比，此处为心肌梗死的边缘，实验中细胞移植注射位置。

2.4.2 注射方法A组：造模成功，在确定心肌梗死边缘后，皮试用注射器将EP管内细胞悬浊液吹打1～2次，使细胞悬浊液充分混匀，抽取100 μL hVEGF165基因转染BMSCs细胞溶液；将注射器针尖部平压于心脏外壁，待局部跳动减弱后，刺入心肌，注入约1/3细胞溶液。同样方法选择另外两注射点将细胞溶液注入心肌中。移植后关闭胸腔，在大鼠恢复自主呼吸后拔除气管插管，撤呼吸机，缝合颈部皮肤；碘伏消毒创面，予青霉素预防感染，送回单笼饲养。B组：于梗死区边缘心肌组织的3个位点直接注入共100 μL的L-DMEM。C组：于梗死区边缘心肌组织的3个位点直接注入共100 μL的空白血清干预后hVEGF165转染BMSCs（细胞密度3×106）。D组：于梗死区边缘心肌组织的3个位点直接注入共100 μL的加味丹参饮含药血清诱导后hVEGF165转染BMSCs（细胞密度3×106）。

2.5 检测指标及方法大鼠IRI造模前后记录心电图，HE染色观察心肌变化及微血管计数。

2.6 统计学处理应用SPSS16.0软件对数据进行统计学分析。计量资料符合正态分布用x±s表示，采用单因素方差分析。

3 结果3.1IRI

大鼠心电图的改变结扎左冠状动脉后，Ⅱ导联见ST段抬高明显，T波高耸；缺血再灌注后，出现病理性Q波；随着时间延长，ST段下移，病理性Q波持续存在。见图1。

3.2 心肌组织形态学改变的观察

3.2.1 肉眼观察心肌形态变化结扎时，可见结扎供血区心肌出现灰白色缺血灶，局部组织可有轻度水肿，再灌注后缺血的心肌转变为红色。7 d后D组结扎部位供血区心肌与正常心肌颜色接近。

3.2.2 光镜下各组7 d时心肌组织形态学变化A组：心肌细胞形态正常，纤维排列整齐有序，肌横纹清晰规则，染色均匀。B组：缺血心肌纤维坏死，纤维瘢痕组织出现于心肌间质，光镜下可见细胞核溶解，缺血边缘见少量血管新生。C组：缺血心肌细胞改变不如B组明显，新生微血管较B组多。D组：缺血心肌细胞改变不如B组及C组明显，新生微血管较B组及C组增多。见图2。

3.3 光镜下4组7 d时心肌微血管计数见表1。

表1 4组光镜下微血管计数比较

表1 4组光镜下微血管计数比较

注：与B组比较，1）P＜0.05；与C组比较，2）P＜0.05。

组别A组B组C组D组微血管计数/个13.6±2.2 15.3±1.7 18.0±1.81）22.5±2.51）2）

4 讨论

胸痹心痛多发于中老年人，其特点为患者年龄渐高，脏腑功能随之衰退，阳气不足，气不行血，心脉瘀阻；或忧思过度，肝失疏泄，气滞则血行不畅，心脉闭阻。加味丹参饮由丹参、赤芍、檀香、川芎、当归、红花、生地黄等组成，本方重用丹参为君以活血祛瘀，辅以赤芍、川芎、当归、红花加强活血化瘀并兼养血行气，佐以檀香行气止痛。

现代药理研究表明：丹参能够增加冠状动脉血流量，改善微循环，促进侧支循环的开放，调节血液在心肌重新分布，从而保护缺血心肌［10］。赤芍中赤芍总苷可改善心肌缺血缺氧状态，从而达到保护心肌的作用［11］。阿魏酸是川芎和当归有效成分，可改善血液循环，从而防止缺血对心肌的进一步损伤［12］。

本实验中采用了成熟的造模方法，运用细胞转染技术研究加味丹参饮对IRI大鼠心肌血管新生的影响。在前期研究中，课题组得出了加味丹参饮含药血清诱导BMSCs移植对心肌IRI模型大鼠梗死心肌边缘区血管新生具有明显的促进作用［13］。本实验以hVEGF165基因转染BMSCs为切入点，观察了细胞移植后第7天心肌微血管再生情况，实验结果显示：细胞移植组和加味丹参饮体外诱导的细胞移植组，与IRI组相比，均可促进心肌微血管再生，且加味丹参饮＋hVEGF165基因转染BMSCs移植组中微血管新生数量较其他组高。这种作用有可能是在hVEGF165基因转染BMSCs后，促进BMSCs血管内皮生长因子分泌，诱导BMSCs分化为血管内皮细胞，进一步促进心肌血管新生的作用有关。

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R285.6

：A

：1000-338X（2016）06-0040-03

2016-09-18

国家自然科学基金资助（30973750）

杨洋（1983—），男，医学博士。研究方向：中西医结合内科临床研究。

黄政德（1955—），男，博士，教授，博士生导师。E-mail：Hzd112 @136.com