基因治疗中重组腺相关病毒载体的安全性

张 梅,于英君(审校)

(黑龙江中医药大学 生物化学与分子生物学教研室,黑龙江 哈尔滨150040)

基因治疗中重组腺相关病毒载体的安全性

张 梅,于英君*(审校)

(黑龙江中医药大学 生物化学与分子生物学教研室,黑龙江 哈尔滨150040)

基因治疗对常用治疗方法难以解决的单基因疾病、癌症、心血管疾病等往往具有良好的疗效。迄今为止，已有超过2000例的基因治疗应用于临床试验[1]，在基因治疗临床试验中超过68%是应用病毒载体。腺相关病毒(AAV)载体由于其基因传递效率高，缺乏致病性和具有良好的安全性而备受青睐[2]。三十多年来，许多应用AAV的基因治疗临床试验取得了成功，rAAV成为人类临床试验的最佳载体之一[3,4,5]，但是我们仍然不能忽视基因治疗的安全性问题。本综述旨在比较全面地探讨针对rAAV的免疫反应、rAAV与载体整合等安全性问题。

1 rAAV载体的免疫反应

截止到2017年2月，全世界已有173项以rAAV作为基因载体的临床研究(http://www.abedia.com/wiley/)。在这些临床前和临床试验中，免疫反应常常影响rAAV的基因治疗效果。rAAV的转基因产物和衣壳蛋白等都是潜在的抗原[6]。人类复杂的免疫系统与这些因素相互作用，成为获得高转导效率和取得长期治疗效果的主要障碍。

1.1 针对rAAV载体的固有免疫反应

研究表明，胞嘧啶脱氨基酶家族的hA3A蛋白为AAV复制的有效抑制剂[7]。人类的hA3A能够绑定病毒单链DNA而干扰其合成。这是目前AAV引起固有免疫的直接证据。补体在AAV引发的免疫反应中扮演着重要的角色，结合补体进化也证实了存在AAV所引起的固有免疫反应[8]。在小鼠体内，巨噬细胞在启动AAV介导的固有免疫反应中起到非常重要的作用。然而，单核/巨噬细胞表达的hA3A限制了AAV在该类细胞中的转导[7]。此外，AAV衣壳蛋白与补体C3结合可抑制巨噬细胞激活及巨噬细胞对AAV的吞噬[8]。上述原因导致了AAV在体内很少有固有免疫。尽管如此，固有免疫是引发获得性免疫的条件，rAAV引发的细胞免疫和体液免疫的存在都说明了AAV引起的固有免疫广泛存在于体内。

1.2 针对rAAV载体的获得性免疫反应

许多研究显示，早年曾有AAV感染而产生的抗体会影响后期AAV作为基因治疗载体的效果[9,10]。不同血清型的AAV的血清中和抗体阳性率是各不相同的。AAV1和AAV2的阳性率是最高的，AAV2也是抗体滴度最高的血清型[11]。目前，AAV7、8、9和AAVrh10正成为临床前研究中常见的血清型[12]。有研究表明，AAV2中和抗体的阳性率明显高于AAV7、8、9 。AAV1抗体阳性率大部分情况下高于AAV7、8、9。大多数携带AAV7、8 、9抗体的受试者体内有抗AAV2的抗体，却很少有携带AAV2抗体的受试者也有AAV7、8、9抗体[13]。来自于各种野生AAV感染后产生的循环免疫球蛋白能够中和各种血清型的rAAV而抑制基因的体内转导。对于同种AAV而言，如果一种AAV给药方式诱导了长期有效的体液免疫反应，那么即使换成另一种给药方式也会影响其应用[14]。通过静脉注射等血管途径给药会影响基因的转导[15]。

有研究显示，在正常人群中存在针对衣壳蛋白的特异性记忆性CD8+T细胞[16]。将从健康志愿者体内分离的带有衣壳蛋白抗体的脾细胞扩增后，60%的脾细胞针对AAV2会出现T细胞反应[17]。体内转导时rAAV重新暴露衣壳蛋白，这些CD8+T细胞即被激活，清除携带衣壳蛋白表位的MHCⅠ复合物的转导细胞，这种清除呈现出载体的剂量依赖性。Martino等建立了小鼠模型来探索衣壳蛋白特异性CD8+T细胞对基因治疗中基因表达的影响，有直接证据显示CD8+T细胞反应清除了小鼠体内已经转导的肝细胞，导致转导基因表达减少[18]。CD8+T细胞反应也在血友病试验、DMD试验等临床试验中被观察到。

在基因治疗中，转移基因的蛋白产物是另一种潜在的抗原。但是，与其他病毒载体相比，rAAV的转移基因免疫普遍比较弱。这主要是因为rAAV不能有效地转导象DC和巨噬细胞这样的APC。然而，一旦转导APC，转基因编码的蛋白质即被蛋白酶体降解，产生的抗原表位负载于MHCⅠ分子上，MHCⅠ限制性抗原递呈最终导致针对靶细胞的CD8+T细胞毒性反应。与被rAAV直接转导相反，APC能够结合分泌蛋白或者吞噬转导细胞，把它们直接递呈给MHCⅡ诱导B细胞免疫和形成抗体，或者交叉递呈给MHCⅠ诱导CD8+T细胞免疫[19]。

2 rAAV载体与宿主染色体的整合

近些年，基因治疗过程中，由载体诱导的致瘤、功能基因断裂、染色体缺失、重排的风险已经受到了广泛的重视。rAAV进入细胞后主要以附加体的形式存在，极少数整合于染色体。但在构建的过程中因目的基因占据了rep基因的位置，进而缺乏了控制定点整合的能力，导致rAAV以低概率与宿主染色体进行同源性非定点整合。rAAV的整合与DNA的修复密切相关，例如，rAAV在S期细胞的整合效率比停滞期细胞高200倍，DNA损伤刺激也能提高rAAV整合效率[20]。rAAV全基因组发生部分降解和在整合前宿主染色体存在缺口是整合发生的条件。

rAAV的随机整合如果发生在基因编码区，就可能发生癌基因激活或者抑癌基因失活，增加癌症发生的风险。近些年有临床前实验报道显示，应用能整合Rian位点相关的ssAAV进行基因传递后，出现了肝细胞癌(HCC)发生率增加的情况[21]。这些研究和逆转录病毒因整合引起的临床致癌案例，使rAAV是一种安全的基因治疗载体的“信仰”受到了挑战。Rosas等试验了各种可能促进rAAV整合的情况。当在经rAAV给药的β-葡萄糖醛酸酶缺乏的新生小鼠体内查出癌症时，rAAV介导的基因治疗能够致癌已经不仅仅是理论上的担忧了[22,23]。多年建立的经rAAV给药的人类和动物的令人鼓舞的安全性数据表明，人类患癌症的风险不能通过啮齿类动物的经验来进行预测。因为在实验性研究中，一些变量潜在影响了癌症发生率，这些变量大多数是啮齿动物的性别、年龄；转基因序列和启动子选择；载体血清型、剂量和给药途径；遗传背景和生活环境。总之，病毒整合将带来一些危险似乎合乎逻辑，但研究连续表明这种危险性相对较低，寻找“安全”整合位点，控制整合频率是未来的研究方向之一。

3 展望

尽管针对rAAV的免疫反应及其随机整合导致的安全问题令其基因治疗遭遇重重阻碍，但是近年来rAAV对癌症、糖尿病等多种顽疾的疗效有目共睹。因此，通过减少rAAV的免疫反应、提高靶向性及发现定点整合安全位点等方式来提高rAAV的安全性是今后研究工作重点，克服上述瓶颈将使rAAV能够更加广泛地应用于基因治疗。

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黑龙江省中医药管理局项目(ZHY16-088)

1007-4287(2017)04-0751-03

张梅(1977-)，女，硕士，讲师，主要从事中药抗肿瘤及肿瘤基因治疗；于英君(1953-)，教授，博士生导师，主要从事中药抗肿瘤及肿瘤基因治疗.

2016-12-06)

*通讯作者