大黄酸对3T3-L1前脂肪细胞增殖分化及相关基因表达的影响

李佳佳，梁耀月，董世芬，杨蓉芳，肖丛瑞，王晶

(北京中医药大学中药学院,北京 100102)



中 药 研 究

大黄酸对3T3-L1前脂肪细胞增殖分化及相关基因表达的影响

李佳佳，梁耀月，董世芬，杨蓉芳，肖丛瑞，王晶*

(北京中医药大学中药学院,北京 100102)

目的：研究大黄酸(1,8-dihydroxy-3-carboxyanthraquinone，Rhein，Rh)对3T3-L1前脂肪细胞增殖分化及相关基因表达的影响，从分子生物学角度探讨大黄酸降脂的作用机理。方法：体外培养3T3-L1前脂肪细胞，采用噻唑蓝法(MTT)研究大黄酸(5、10、20、40、80、160 μM)对3T3-L1前脂肪细胞增殖活性的影响；大黄酸(20、40、80 μM)干预3T3-L1脂肪细胞诱导分化，油红O染色分析大黄酸对3T3-L1脂肪细胞分化过程中胞浆脂滴积累的影响；生化法检测大黄酸对3T3-L1脂肪细胞中甘油三酯(Triglyceride，TG)的影响；实时荧光PCR法检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisome Proliferator Activated Receptor Gamma，PPARγ)、CCAAT增强子结合蛋白(CCAAT/enhancer binding protein，C/EBPα)、脂肪酸合成酶(Fatty acid synthetase，FAS)mRNA的表达水平。结果：大黄酸160 μM对3T3-L1前脂肪的增殖有显著的抑制作用，大黄酸20、40、80 μM剂量依赖地降低3T3-L1脂肪细胞中脂滴的积累，同时显著降低3T3-L1脂肪细胞中TG含量，并且下调3T3细胞中脂肪分化相关基因PPARγ、C/EBPα、FAS mRNA的表达。结论：大黄酸能够抑制3T3-L1脂肪细胞的诱导分化，降低细胞内TG含量，其作用机制可能与下调脂肪分化相关基因PPARγ、C/EBPα、FAS mRNA的表达有关。

大黄酸；3T3-L1前脂肪细胞；增殖分化；基因表达

肥胖是一种多因素引起的慢性代谢性疾病，是引发高脂血症、动脉粥样硬化、冠心病、糖尿病等肥胖相关疾病的重要因素。而肥胖是代谢综合征的主要组成之一，亦是糖尿病、心血管疾病的独立危险因子[1]。前体脂肪细胞的过度分化直接导致肥胖的发生、发展。因此，抑制前体脂肪的分化，研究脂肪组织中调控前脂肪细胞转化为脂肪细胞的分子机制，对于预防肥胖的相关疾病有重要的意义。3T3-L1前脂肪细胞来源于小鼠胚胎成纤维细胞，具有单一的分化潜能[2]，体外经过诱导分化后可以分化为成熟的脂肪细胞。目前已成为国内外研究脂肪代谢最常用的细胞株之一。

大黄来源于蓼科植物掌叶大黄(RheumpalmatumL)、唐古特大黄(RheumtanguticumMaxim．ex Balf)或药用大黄(RheumofficinaleBaill)的干燥根及根茎，性苦、寒，具有泻下攻积、清热泻火、凉血解毒、逐瘀通经、利湿退黄之功效[3]。《神农本草经》谓大黄“主下瘀血、血闭、寒热，破癥瘕积聚，留饮宿食，荡涤肠胃，推陈致新”，其所治病证与高脂血症“痰浊”“污血”“浊血”“瘀血”的病机相符[4]。现代研究表明，大黄具有减轻体质量，降低血脂等作用[5]。大黄酸是大黄主要有效成分之一，为蒽醌衍生物，具有降血糖[6]、抗病原微生物[7]、抗肿瘤[8]等药理作用，并且大黄酸也是大黄提取物中唯一吸收入血检测到的蒽醌类成分[9]。研究发现，大黄酸可以降低糖尿病肥胖大鼠脂肪组织抵抗素的表达，降低游离脂肪酸和血脂水平[10-11]；能够降低高脂血症小鼠肝脏脂肪含量，抑制脂肪在肝脏的沉积[12]。然而，目前其降脂的作用机制尚未完全清楚。本研究以3T3-L1前脂肪细胞为研究对象，探讨大黄酸对3T3-L1前脂肪细胞增殖分化以及对脂肪分化相关基因表达的影响，以期为阐明大黄降脂的作用机制提供理论依据。

1 材料

1.1 细胞来源

3T3-L1前脂肪细胞株，购自北京协和细胞资源中心。

1.2 试剂与材料

大黄酸(北京华威锐科化工有限公司，批号16HC0210-2)；胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)(美国Corning公司，批号35076115)；DMEM高糖培养基(美国Corning公司，批号21115003)；新生牛血清(四季青生物工程公司，批号20151113)；牛胰岛素(Insullin，美国Sigma公司，批号11070-73-8)；3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(3-Isobutyl-1-methylxanthine，IBMX)(美国Sigma公司，批号10163375)；地塞米松(美国Sigma公司，批号D1756)；噻唑蓝(3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-diphenytetrazoliumromid，MTT)(北京Biodee公司，批号298-93-1)；油红O(北京Biodee公司，批号1320-06-5)；Triton-X100(北京Biodee公司，批号9002-93-1)；总蛋白定量测试盒(BCA法)(南京建成生物科技有限公司，批号20160704)；甘油三酯(TG)测试盒(南京建成生物科技有限公司，批号20160525)；Trizol试剂盒(美国Thermo公司，批号113705)；Revert Aid First Stand cDNA Synthesis Kit(美国Thermo公司，批号00285939)；SYBR Select Mast Mix: ABI(美国Thermo公司，批号1510506)；Fast Reaction Tubes: Applied Biosystems(美国Thermo公司，批号4323032)。

1.3 仪器

CO2恒温培养箱(RCO-3000T-5V型，美国G.S.公司)；酶标仪(ThermoLabsystems Multiskan Mk3，美国Thermo公司)；倒置相差显微镜(DMILHC，德国Leica公司)；电泳仪(DYCP-31DN型，北京市六一仪器厂)；凝胶成像分析仪(Tannon 1600，上海天能科技有限公司)；Nano-200超微量核酸分析仪(杭州奥盛仪器有限公司)；StepOne Plus实时荧光定量PCR仪(ABI，美国)。

2 方法

2.1 细胞的培养

3T3-L1前脂肪细胞，用含10%新生牛血清的DMEM高糖培养液在5% CO2培养箱中培养，每2～3 d更换1次培养液，显微镜下观察细胞的生长状况，细胞融合度达到80%时，用0.25% EDTA胰酶消化种板。

2.2 MTT法检测大黄酸对3T3-L1前脂肪细胞增殖活性的影响

选取对数生长期的3T3-L1前脂肪细胞，按1×104个/mL接种于96孔板，每孔加入细胞悬液200 μL，置于CO2培养箱中孵育24 h后，吸弃培养孔中的培养基，给药组分别加入含一定浓度梯度的大黄酸(5、10、20、40、80、160 μM)培养基干预培养，每组设5个平行复孔，另设前脂肪细胞组(Preadipocyte)和DMSO溶剂对照组(DMSO)，分别培养24 h、48 h、72 h。至所需的时间后，弃去培养孔中的培养基，PBS洗1次。加入终浓度为1 mg/mL的MTT溶液，200 μL/孔，37℃培养箱孵育4 h后，细胞内形成蓝紫色结晶。弃去MTT溶液，每孔加入150 μL的DMSO，轻微震荡10min，使细胞内蓝紫色结晶完全溶解后，于酶标仪490 nm波长处测定吸光度(A)。用GraphPad Prism 6计算公式，计算各时间点的IC50值。

细胞存活率(%)=A药物组/A对照组×100%

2.3 3T3-L1脂肪细胞诱导分化

将3T3-L1前脂肪细接种到24孔或者6孔板中进行诱导分化。培养至接触抑制后第2天，脂肪细胞组(Adipocyte)开始诱导分化，更换诱导液Ⅰ(含10%FBS，5 μg/mL胰岛素，1 μmol/L地塞米松，0.5 mmol/L IBMX的DMEM高糖培基)，这一天记为诱导分化D0。D2，吸弃旧的培养基，更换诱导液I继续培养。D3，吸弃旧的培养基，更换诱导液Ⅱ(含5 μg/mL胰岛素的10% FBS的DMEM高糖培基)培养。D4，吸弃旧的培养基，更换诱导液Ⅲ(含10% FBS的DMEM高糖培养基)培养。这之后，每隔1 d，用诱导液Ⅲ换液，至D10收集细胞测定。

大黄酸分为20 μM组(Rh 20 μM)、40μM组(Rh 20 μM)、80 μM组(Rh 20 μM)和0.2% DMSO组(0.2% DMSO)，从诱导分化的D3开始给药。D3药物溶于诱导液II处理细胞，D4开始，药物溶于诱导液III处理细胞，隔天换液，至D10天收集细胞测定。

另设前脂肪细胞组从诱导分化D0开始，用诱导液Ⅲ培养细胞，隔天换液。

2.4 油红O染色

3T3-L1前脂肪细胞接种于24孔板中，第10 d后，吸弃培养液，PBS漂洗2次后用中性甲醛固定30 min。弃固定液，PBS漂洗后加入油红O工作液，每孔400 μL，室温染色1 h。吸弃油红染液，用60%的异丙醇洗去浮色，PBS漂洗后在PBS液中镜下观察拍照。拍照结束，吸弃PBS液，加入4% NP-40(溶于异丙醇中)，温和振荡5 min，经油红O染色的3T3-L1脂肪细胞可溶于4% NP-40溶液中，收集溶液，于540 nm处测定A值，即可定量测得油红O染色脂滴含量。

细胞分化抑制率(%)=(A对照组-A药物组)/A对照组×100%

2.5 TG含量测定

诱导分化完成后，细胞刮刀收集细胞，2% Triton X-100裂解细胞，超声细胞破碎仪破碎细胞1 min，参照试剂盒说明书，检测3T3-L1脂肪细胞中甘油三酯含量。BCA法测定蛋白浓度，以mmol/g prot校正细胞内TG含量。

2.6 实时荧光定量PCR检测相关基因的表达

诱导分化完成后，用Trizol试剂提取各实验组细胞中的总RNA，超微量核酸分析仪计算浓度，Revert Aid First Stand cDNA Synthesis Kit合成cDNA，SYBR Select Mast Mix: ABI配制10 μl反应体系，采用StepOne Plus实时荧光定量PCR检测3T3-L1脂肪细胞相关基因的表达。PCR引物序列(见表1)。以β-actin为内参基因，分别计算各组2-ΔΔCT，表示脂肪细胞分化转录因子PPARγ、C/EBPα、FAS的mRNA的相对表达量。

表1 PCR引物序列及产物大小

2.7 统计学处理

数据用SAS 9.3软件进行统计分析。多组之间的比较用单因素方差分析，方差不齐或两组之间的比较用t检验。数据皆以(Means±SD)表示，P<0.05为有显著性差异。

3 结果与分析

3.1 大黄酸对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响

由图1可以看出，大黄酸对3T3-L1前脂肪增殖有抑制作用。随着剂量的增大，抑制作用逐渐增强。给药24 h、48 h、72 h后，大黄酸对3T3-L1前脂肪细胞的IC50值分别为187.70 μM、285.44 μM、230.95 μM。由此可见，大黄酸在20～80 μM之间对3T3-L1前脂肪细胞各个时间点的增殖无明显影响，由此设大黄酸20、40、80 μM三个剂量组，考察大黄酸对3T3-L1脂肪细胞诱导分化的影响。

图1 大黄酸对3T3-L1前脂肪细胞增殖活性的影响(Meams±SD，n=5)注：与Preadipocyte组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3.2 大黄酸对3T3-L1脂肪细胞分化的影响

3T3-L1脂肪细胞分化成熟时，体积增大，细胞胞浆出现脂滴，经过油红O染色，呈现“戎环”样，是分化成熟的标志。如图3所示，与对照组比，大黄酸40 μM、80 μM均可以减少脂滴的数目和体积；将脂滴溶解于NP-40中，测定OD值可以定量检测脂滴积累情况，前脂肪细胞组细胞未分化，基本没有脂滴出现，大黄酸20 μM、40 μM、80 μM三个剂量组分别不同程度地抑制3T3-L1脂肪细胞的分化。其中大黄酸40 μM、80 μM可显著地抑制3T3-L1脂肪细胞的分化(P<0.05或P<0.01)，抑制率分别为16.47%、51.76%。(见图2)。

图2 大黄酸对3T3-L1脂肪细胞分化的影响(Meams±SD，n=4)注：与Adipocyte组比较，*P<0.05，**P<0.01。

图3 油红O染色示意图(×200)注：A.对照组；B.Rh 40 μM；C.Rh 80 μM。

3.3 大黄酸对3T3-L1脂肪细胞TG的影响

从图4可以看出，前脂肪细胞组3T3-L1前脂肪细胞中，TG含量极低。与对照组相比，大黄酸20 μM、40 μM、80 μM均显著降低了3T3-L1脂肪细胞中TG含量(P<0.01，P<0.001)。

图4 大黄酸对3T3-L1脂肪细胞TG的影响(Meams±SD，n=3)注：与Adipocyte组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

3.4 大黄酸对3T3-L1脂肪细胞相关基因表达的影响

大黄酸作用于3T3-L1脂肪细胞后，与对照组相比，各剂量组均不同程度降低了PPARγ、C/EBPα mRNA的相对表达量。其中大黄酸80 μM显著地降低了3T3-L1脂肪细胞中PPARγ、C/EBPα的表达量(P<0.001)。FAS是脂肪细胞内的主要酶，大黄酸给药干预后，与对照组比，20 μM剂量组FAS相对表达量增高(P<0.05)，40 μM、80 μM两个剂量组FAS的表达量显著降低(P<0.01或P<0.001)见图5。

图5 大黄酸对3T3-L1脂肪细胞相关基因表达的影响(Meams±SD，n=3)注：与Adipocyte组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

4 讨论

脂肪是生物体内能量贮存的主要形式，具有极其重要的生理功能，与机体的代谢密切相关，脂肪细胞分化异常可引起脂肪过多的积聚，从而导致肥胖、心血管疾病及糖尿病等的发生[13]。大黄酸干预3T3-L1脂肪细胞诱导分化结果显示，大黄酸20 μM、40 μM、80 μM均可以显著地抑制3T3-L1细胞的分化，减少胞浆中的脂滴的积聚；对3T3-L1脂肪细胞中TG含量定量检测发现，大黄酸20 μM、40 μM、80 μM显著地降低细胞中TG含量，随着剂量增大，抑制作用增强，在降脂方面具有研究价值。

3T3-L1前脂肪细胞向脂肪细胞分化过程需经过细胞融合前增殖、融合/生长停滞、激素诱导/克隆扩增、永久性生长停滞/分化这四个阶段，最终分化成为脂肪细胞[14]。3T3-L1脂肪细胞分化过程，受到多种激素、基因以及信号转导通路的调控。众多转录因子PPARs、C/EBPs、aP2、LPL等参与脂肪细胞分化过程。PPAR和C/EBPα在调控中起决定性的作用[15-16]。在诱导分化早期，C/EBPβ与C/EBPδ是最早表达的转录因子，能够诱导PPARγ及C/EBPα的表达[17-18]，诱导分化的第2天，PPARγ、C/EBPα基因开始表达，3～5天后达到高峰[15,19]。PPARγ是棕色、白色脂肪细胞分化过程中必须的调控因子[20]，在胰岛素抵抗、动脉粥样硬化、脂质代谢与糖代谢、脂肪细胞分化和能量平衡方面起着重要的调节作用[21]，能够调节C/EBP、脂代谢关键酶、以及转运蛋白等的表达，进而影响脂肪细胞分化进程。C/EBPα是CCAAT增强子结合蛋白(C/EBPs)家族的重要成员，参与前脂肪细胞分化的调控[22]，只有PPARγ存在的条件下，C/EBPα才能诱导成脂化发生，而当不表达PPARγ时，C/EBPα不能促使脂化发生[23]，同时PPARγ能够刺激前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞，与脂肪形成密切相关。为进一步探讨大黄酸抑制3T3-L1脂肪细胞分化的作用机制，在诱导分化的第3 d给予大黄酸干预，考察大黄酸对3T3-L1脂肪细胞早期标记因子PPARγ和C/EBPα mRNA表达的影响，实验结果显示，大黄酸80 μM能够显著下调脂肪诱导分化转录因子PPARγ和C/EBPα mRNA的表达，这可能是大黄酸抑制3T3-L1脂肪细胞诱导分化的机制之一。

FAS主要存在于肝脏、脂肪等组织中，在体内催化单酰辅酶A和丙二酰辅酶A结合成长链脂肪酸，是合成脂肪酸的关键酶[24]，与肥胖等疾病密切相关。研究表明，高脂饮食诱导肥胖大鼠脂肪组织FAS的mRNA水平升高，而肥胖抵抗的大鼠脂肪组织FAS的mRNA的表达显著降低[25]。FAS出现在脂肪分化的中后期，当脂肪细胞分化时，脂滴增多，FAS表达增加[26]，FAS也是PPARγ下游涉及脂类存储和调节脂代谢的靶基因[27-28]，受PPARγ的调控，增加脂肪细胞中脂滴的积聚，大黄酸40 μM、80 μM能够显著降低FAS mRNA的表达，表明大黄酸通过降低FAS mRNA的表达，从而抑制胞浆内脂质积累，减少了前脂肪细胞向脂肪细胞的转化。

综上所述，大黄酸能够抑制3T3-L1脂肪细胞的诱导分化，降低细胞内TG含量，下调脂肪分化相关基因PPARγ、C/EBPα、FAS mRNA的表达，在降血脂、防治心血管疾病方面具有潜在价值。但体外实验和体内实验还是存在一定差异，因此进一步研究大黄酸对于脂质代谢的影响，探讨其在体内作用机制具有重要的意义。

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Effect of Rhein on 3T3-L1 Preadipocyte Differentiation and Related Gene Expression

LI Jia-jia, LIANG Yao-yue, DONG Shi-fen, YANG Rong-fang, XIAO Cong-rui, WANG Jing*

(SchoolofChinesePharmacy,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100102,China)

Objective:The effect of rhein (1,8-dihydroxy-3-carboxyanthraquinone，Rhein，Rh) on the proliferation and differentiation of 3T3-L1 adipocyte and the related gene mRNA expression was investigated. Method:MTT assay was used to detect 3T3-L1 cell proliferation by rhein (5,10,20,40,80,160 μM), rhein intervention 3T3-L1 adipocytes induced differentiation, oil red O staining and colorimetric analysis of the impact of rhein on 3T3-L1 adipocyte differentiation process of the accumulation of lipid droplets in the cytoplasm, biochemical detected rhein 3T3-L1 adipocytes triglyceride (TG). The expression of CCAAT enhancer binding proteins (C/EBPα), fatty acid synthetase (FAS), peroxisome proliferators activated receptor γ (PPARγ) genes was measured by real-time PCR. Results:The results showed that rhein(20,40,80 μM) could inhibit adipocyte differentiation and reduce intracellular TG content in a dose-dependent manner. Furthermore, rhein down-regulated the mRNA expression of C/EBPα, FAS, and PPARγ genes. Conclusion:Rhein can inhibit the differentiation of 3T3-L1 adipocytes,and the mechanism of action may be related to reducing adipose differentiation-related gene PPARγ,C/EBPα and FAS expression.

Rhein; 3T3-L1 preadipocytes; Proliferation and differentiation; Gene expression

国家自然科学基金资助项目(No.81503287，81430094)；教育部博士点基金项目(No.20130013120002)

李佳佳(1990-)，女，硕士，主要研究方向：中药防治心脑血管疾病的研究。

王晶*(1973-)，女，副教授，硕士研究生导师，主要研究方向：中药防治心脑血管疾病的研究。

2016-08-16

R285.5

A

1002-2406(2017)01-0001-05

修回日期：2016-09-10