HPLC-ELSD法同时测定无梗五加果中3种3,4-裂环羽扇豆烷型三萜化合物的含量

吴高松，王知斌，杨春娟，刘华，王秋红，杨炳友，匡海学

(黑龙江中医药大学，教育部北药基础与应用研究重点实验室/黑龙江省中药天然药物药效物质基础重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150040)



HPLC-ELSD法同时测定无梗五加果中3种3,4-裂环羽扇豆烷型三萜化合物的含量

吴高松，王知斌，杨春娟，刘华，王秋红，杨炳友，匡海学*

(黑龙江中医药大学，教育部北药基础与应用研究重点实验室/黑龙江省中药天然药物药效物质基础重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150040)

目的：建立HPLC-ELSD法同时测定无梗五加果中22-α-hydroxychiisanogenin(1)、chiisanogenin(2)和(1R, 11α)1, 4-epoxy-11-hydroxy-3, 4-secolupane-20(30)-ene-3, 28-dioic acid(3)的含量方法测定。方法：采用Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，流动相为甲醇-0.2%(V/V)乙酸水溶液梯度洗脱，流速1.0 mL/min，柱温为25℃，使用蒸发光散射检测气(载气流速1.60 L/min，蒸发温度60℃，漂移管温度45℃)。结果：在70 min内，无梗五加果中上述3个成分完全分离，峰面积的对数与进样量的对数呈现良好的线性关系(r=0.999 5～0.999 7)；平均加样回收率(n=6)分别为102.9%(RSD=1.9%)、95.4%(RSD=3.0%)、98.7%(RSD=2.3%)。样品中化合物1～3的含量分别为9.37～9.61、2.03～2.18、0.39～0.45 mg/g。结论：该方法简单、快速、结果可靠，可用于同时测定无梗五加果中化合物1～3的含量。

无梗五加果；高效液相色谱-蒸发光散射检测；含量测定

无梗五加[Acanthopanaxsessiliflorus(Rupr.et Maxim.) Seem.]为五加科五加属植物，又称短梗五加。主要分布在中国东北地区，河北、山西、内蒙古等地亦有分布。无梗五加中含有丰富的黄酮类、有机酸类、香豆素类、萜类以及糖类化合物[1-4]。《中华本草》记载，无梗五加的根茎具有祛风湿、补肝肾、强筋骨、活血脉的作用[5]。三萜类成分为无梗五加果中主要的活性成分之一，裂环羽扇豆烷型三萜化合物是无梗五加果中的特征成分，本课题组首次采用HPLC-ELSD测定这3种成分的含量，可为无梗五加果的质量控制提供实验依据。

1 仪器与材料

Agilent 1260高效液相色谱仪(包括四元泵、自动进样器、柱温箱、Agilent 1290蒸发光散射检测器)；KQ-500DB超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；AK2140电子天平(上海奥豪斯公司)。

HPLC流动相甲醇为色谱纯(美国Fisher公司)，醋酸为色谱纯(美国Fisher公司);其余试剂均为分析。

对照品22-α-hydroxychiisanogenin(化合物1)、chiisanogenin(化合物2)、(1R,11α)1,4-epoxy-11-hydroxy-3, 4-secolupane-20(30)-ene-3,28-dioic acid (化合物3)(图1)为实验室从无梗五加果中分离得到，通过MS、NMR鉴定其结构，HPLC测得其纯度均≥98%(峰面积归一化法)；无梗五加果于2014年12月购买于黑龙江省三棵树药材市场，产地为黑龙江省，经黑龙江中医药大学王振月教授鉴定为无梗五加[Acanthopanaxsessiliflorus(Rupr. et Maxim.)Seem.]的果实。

图1 化合物1～3的结构式

2 方法与结果

2.1 混合对照品储备溶液制备

精密称取各对照品适量，加甲醇配制成每1 mL含0.751 mg的化合物1、0.227 mg的化合物2、0.336 mg的化合物3的混合溶液，即得。

2.2 供试品溶液制备

精密称取1.0 g无梗五加果干燥成熟果实粉末，料液比1∶20，甲醇-乙腈(1∶2，V/V)回流提取3次，合并3次滤液减压浓缩，制得浸膏，加10 mL水超声混悬，用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层，减压浓缩得浸膏，甲醇定容至50 mL，经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 色谱条件

色谱柱Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)，流动相A为甲醇，B为0.2%(V/V)乙酸水；梯度洗脱程序：0 min，55% A，20 min，68% A，35 min，80% A，60 min，85% A，流速1.0 mL/min，柱温25 ℃；ELSD参数：蒸发温度60 ℃，漂移管温度45 ℃，氮气流速1.60 L/min，进样量20 μL。对照品及样品色谱图见图2。

2.4 线性关系考察

精密吸取“2.1”项下的混合对照品储备液0.5 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL分别置于10 mL容量瓶中，定容至刻度，按“2.3”项下色谱条件进样测定，以进样量的对数和对应峰面积的对数计算回归方程。化合物1～3的回归方程分别为Y=16.41X-484.1(r=0.999 5)，线性范围37.55～751.0 μg/mL；Y=23.78X-201.9(r=0.999 6)，线性范围11.35～227.0 μg/mL；Y=27.54X-32.44(r=0.999 7)，线性范围4.000～336.0 μg/mL。

图2 混合对照品(A)、样品(B)的HPLC色谱图

2.5 仪器精密度考察

取“2.1”项下的混合对照品储备液，按照“2.3”项下色谱条件连续进样6次，化合物1～3的峰面积RSD分别为0.36%、0.56%、1.1%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性考察

取无梗五加果药材粉末1.0 g/份，6份，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.3”项下色谱条件进行含量测定，测得样品中化合物1～3的RSD分别为1.1%、1.8%、2.6%，均小于<3%，表明该方法重复性好。

2.7 稳定性考察

取同一供试品溶液于室温下放置，分别于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h按照上述色谱条件进样测定，化合物1～3的峰面积RSD分别为0.92%、0.89%、0.98%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.8 加样回收率试验

精密称定已经含量的样品0.5 g，共6份，分别精密加入低、中、高3个加入量的对照品储备液(每个加入量3份)，按照“2.2”项下制备供试品溶液，然后按“2.3”项下色谱条件测定，计算回收率。结果化合物1～3的平均回收率分别为102.9%(RSD=2.9%)、95.4%(RSD=3.0%)、98.7%(RSD=2.3%)。表示该提取方法准确度较好，基本符合试验要求。

2.9 含量测定

取无梗五加果粉末，精密称定1.0 g，按照上述方法进行测定，由回归方程计算化合物1～3的含量。结果见表1。

表1 化合物1～3在无梗五加中的含量(mg/g，n=3)

注：括号内为RSD值。

3 讨论

3.1 含量测定方法的选择

目前无梗五加果中除三萜类成分的含量测定方法外，其他成分的含量测定相对成熟，基本采用的都是HPLC-UV法[6-10]，但是由于三萜成分的紫外吸收波长短(203 nm)，干扰成分多，故不适合三萜类成分的分析。有研究报道三萜成分主要采用的研究方法是HPLC-ELSD和UPLC-MS，但是UPLC-MS作为体外质量控制研究而言不具有实用性，故本文采用了HPLC-ELSD来建立无梗五加果中三萜成分含量测定方法，该检测器对挥发性高于流动相的物质均适用，且对各种物质的响应度几乎相同。

3.2 流动相系统及分析时间的选择

这3种化合物属于三萜苷元，极性较小，更易溶于甲醇-乙腈中，故本实验采用的提取溶剂为甲醇∶乙腈(1∶2,V/V)。由于3种三萜化合物的极性较为接近，为了得到较好的分离度和缩短分析时间，选择了梯度洗脱模式。本实验研究了向流动相(甲醇-水体系和乙腈-水体系)加入乙酸和磷酸对样品分离效果的改善，最终确定以甲醇-0.2%乙酸水溶液系统作为流动相，可以获得样品中待测物质的峰和其他组分的峰有良好分离度，在70 min以内ELSD检测器对3种三萜化合物成分的峰与相邻色谱峰的分离度大于1.5。

无梗五加果中三萜类成分的含量较高，对其三萜类成分的药理活性深入研究可为无梗五加果的药用价值的研究提供依据。

[1] 郭丽娜,江黎明,吴立军,等.无梗五加茎叶化学成分的研究[J].沈阳药科大学学报,2002,19(3):180-182.

[2] Yang CJ,Wang ZB,Song PY,et al.Monoterpenoids from Acanthopanax sessiliflorus Fruits[J].Molecules,2013,18(3):3043-3049.

[3] An Q, Yang CJ, Song Y, et al. Studies on the Chemical Constituents of the Fruit of Acanthopanax sessiliflorus (Rupr. etMaxim.) Seem[J].Nat Prod Res Dev,2008,20(5):765-769.

[4] 孟永海，王欣慰，翟春梅，等.短梗五加果中木脂素类成分的分离和鉴定[J].中医药信息，2016,33(2):1-4.

[5] 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草[M].15卷.上海:上海科学技术出版社,1997:760.

[6] 韩莹,李遇伯,崔兰冲,等.HPLC法同时测定无梗五加果中东莨菪内酯和异嗪皮啶的含量[J].沈阳药科大学学报,2006,23(9):573-576.

[7] 张智超,刘玉强,才谦.无梗五加果实中东莨菪内酯和东莨菪内酯苷测定研究[J].中成药,2013,35(7):1508-1511.

[8] 李林,才谦.HPLC法同时测定无梗五加果实中金丝桃苷和东莨菪内酯的含量[J].亚太传统医药,2010,57(5):25-27.

[9] 高凤兰,孙振方,郑春英,等.高效液相法测定无梗五加甙D含量[J].中国中医药科技,1998,5(1):41.

[10] 刘玉强,才谦.HPLC同时测定无梗五加果实中金丝桃苷和槲皮素-4′-O-β-D-半乳糖苷的含量[J].药物分析杂志,2013,33(2):206-209.

Simultaneous Determination of Three 3,4-seco-Lupane-type Triterpenoids in Acanthopanax Sessiliflorus Fruits by HPLC-ELSD

WU Gao-song, WANG Zhi-bin, YANG Chun-juan, LIU Hua, WANG Qiu-hong,YANG Bing-you, KUANG Hai-xue*

(KeyLaboratoryofChineseMateriaMedica(MinistryofEducation),HeilongjangKeyLaboratoryofTCMPharmacodynamicMaterialBases,HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

Objective: To establish a high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detection (HPLC-EISD) method for the simultaneous determination of 22-α-hydroxychiisanogenin (1), chiisanogenin (2), (1R, 11α)1, 4-epoxy-11-hydroxy-3, 4-secolupane-20(30)-ene-3, 28-dioic acid (3) in the Acanthopanax sessiliflorus fruits. Methods: The Diamonsil C18column (250 mm×4.6 mm, 5 μm) was used,using gradient elution with a mobile phase of methanol as solvent A and 0.2% (V/V) acetic acid in water as solvent B; the flow rate was 1.0 mL/min; the column temperature was maintained at 25℃. The ELSD conditions were as follows: the evaporative temperature was set at 60℃; the drift tube temperature was set at 45℃; the gas flow rate was 1.60 L/min. Results: The three compounds were completely separated within 70 min. The regression equation showed a good liner relationship between logarithm of the peak area and logarithm of the content of each compound (r=0.999 5-0.999 7). The average recoveries (n=6) were 102.9%(RSD=1.9%), 95.4%(RSD=3.0%)and 98.7%(RSD=2.3%), respectively. The contents of compounds 1-3 in samples were 9.37-9.61,2.03-2.18,0.39-0.45 mg/g, respectively. Conclusion: The method is simple, fast and reliable, which can be used to determine the contents of compounds 1-3 in A. sessiliflorus fruit.

Acanthopanax sessiliflorus fruit; HPLC-ELSD; Determination

国家重点基础研究发展计划-973计划(No.2013CB531801)；黑龙江中医药大学“优秀创新人才”支持项目(No.2012RCD05)；黑龙江中医药大学“杰出人才培养”基金项目(No.2012cj02)

吴高松(1989-)，男，硕士研究生，主要从事中药药效物质基础研究工作。

匡海学*(1955-)，男，教授，博士研究生导师，主要从事中药性味理论和中药药效物质基础研究工作。

2016-07-13

R284

A

1002-2406(2017)01-0036-03

修回日期：2016-08-04