快速膜乳化法制备齐墩果酸微粒的工艺研究

吴晨悦，范文硕，田娟，蔡程科

(北京中医药大学中药学院，北京 100102)



质 量 工 艺

快速膜乳化法制备齐墩果酸微粒的工艺研究

吴晨悦，范文硕，田娟，蔡程科*

(北京中医药大学中药学院，北京 100102)

目的：初步建立无包载辅料的齐墩果酸微粒的制备方法，对制备工艺进行考察和优化，得到分散性好、粒径均一、分布窄的齐墩果酸微粒。方法：以齐墩果酸微粒的平均粒径Z-average、多分散指数PDI为主要指标，辅以电镜观察，对影响齐墩果酸微粒成型和分散性的各因素进行考察。结果：制备的齐墩果酸微粒冻干粉平均粒径(434.7±39.06)nm，PDI(0.25±0.08)，大小均匀，分散性好。结论：不锈钢快速膜乳化法可用于中药难溶性成分齐墩果酸的微粒制备，具有良好的开发前景。

齐墩果酸；快速膜乳化法；微粒

齐墩果酸(Oleanolic acid,OA)是中药中重要的有效成分之一，为五环三萜类化合物，白色针状结晶，不溶于水；在自然界中分布广泛[1]。OA具有护肝降酶、抗肿瘤、抗炎、抗突变、抗癌、降糖、降血脂、免疫双向调节等多种药理作用，临床上主要用于治疗急慢性病毒性肝炎、传染性急性黄疸型肝炎，具有明显的降谷丙转氨酶及退黄效果，对症状、体征和肝功能均有明显的改善作用[2]。OA属于低溶解性-低渗透性药物，在25℃时水中溶解度仅为4.61 μg/ml，37℃时为17.59 μg/ml[3]，在Caco-2单层细胞的表观渗透系数Papp为1.11.3×10-6cm/s[4]，影响了在胃肠道的溶出和吸收，导致生物利用度低，严重限制了其药理作用的充分发挥。目前上市的齐墩果酸制剂主要是片剂和胶囊剂，急慢性肝炎患者每日最低服用量分别达30 mg、90 mg，因此有必要利用制剂技术提高其在生物体内的溶解度及溶出速度，以提高生物利用度。

本研究应用快速膜乳化法制备不含辅料的齐墩果酸微粒，以平均粒径(Z-average)和多分散指数PDI值为考察指标，辅以电镜下观察OA微粒形态及分散状态，对OA微粒的制备工艺进行初步考察。

1 材料与仪器

1.1 试药

齐墩果酸原料(南京狄尔格医药科技有限公司，批号D151106020，纯度>98%)；PVA 088-20(山西三维集团股份有限公司)；乙酸乙酯(美国Fisher 有限公司，色谱纯)；NaCl(北京化工厂)；葡萄糖、乳糖、甘露醇(北京化工厂)；蔗糖(国药集团化学试剂有限公司)。

1.2 仪器

快速膜乳化器(中国科学院过程工程研究所)；不锈钢膜(自制)；RT10高效10点加热磁力搅拌器(德国IKA公司)；3-18N高速离心机(湖南恒诺仪器设备有限公司)；KH-7200DE型数控超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)；LGJ-12冷冻干燥机(北京松原华兴科技发展有限公司)；Quanta-250扫描电子显微镜(美国FEI公司)；ZetaSizer Nano-ZS 90激光粒径测试仪(英国马尔文仪器有限公司)。

2 方法与结果

2.1 齐墩果酸微粒制备

应用四级串联不锈钢快速膜乳化法[5]制备齐墩果酸微粒。

将OA原料在70℃条件下溶解于乙酸乙酯中，经0.45 μm滤膜过滤，作为油相。将PVA088-20在磁力搅拌(70℃、480 r/min)条件下溶解于去离子水中，至无明显颗粒状物质，趁热经0.8 μm滤膜过滤，冷却，作为水相。油相与水相混合、震摇形成初乳后，倒入快速膜乳化装置，在N2压力作用下通过四级串联的不锈钢膜，反复过膜3次。过膜后的乳液迅速倒入预先准备好的固化液中，磁力搅拌(480 r/min)至无乙酸乙酯气味，使微粒充分析出。固化后的乳液加入去离子水离心清洗4次，冷冻干燥。

2.2 评价指标

2.2.1 微粒形态

取少量OA微粒冻干粉制扫描电镜用样品，观察样品形态。OA原料与OA微粒在扫描电镜下成像如图1所示。

图1 OA原料及OA微粒SEM图

2.2.2 平均粒径及多分散指数

图2 OA微粒粒径分布图

2.3 齐墩果酸微粒制备影响因素考察

根据前期经验，按照水相PVA浓度4%、油相浓度0.3%、油相：水相1∶4、过膜压力600KPa、过膜后乳液：固化液1∶3、离心速度9 000r/min的条件初步制备了OA微粒，OA微粒形貌如图3所示。为改善OA微粒冻干粉的成型及分散性，对可能影响其分散的各个因素进行了逐一考察。文中如无特别说明，条件如上。

图3 试制OA微粒SEM图

2.3.1 过膜后乳液与固化液体积比考察

对不同的乳液与固化液体积比考察如表2所示，微粒成型如图4所示。结果显示，随着固化液体积比增大，Z-average及PDI均有减小的趋势。SEM可观察到1∶2与1∶4两组，微粒成型较差，存在大量片状物，可以推测1∶2、1∶4两批中残留了PVA，在粒径检测时溶解于水中，致平均粒径减小。综合扫描电镜与粒径检测结果，以过膜后乳液与固化液体积比1:5时微粒成型状态、平均粒径及PDI值均较好。

表2 固化液体积考察试验表

2.3.2 离心速度考察

为提高微粒再分散性同时保证PVA完全除去，将固化后的乳液用去离子水稀释1倍后离心。不同离心速度考察及结果如表3。在4 500r/min的条件下，离心时间达到50min仍然没有药物分离出。由粒径分布结果可知：6 000r/min和8 000r/min离心效果较好，但是离心速度慢耗时长，效率低；第一次离心8 000r/min时，加水洗涤时不容易分散均匀，OA微粒黏连较严重。为改善上述情况，选择6 500r/min，30min+6 500r/min，10min×4次进行洗涤，粒径检测结果如图5所示，Z-average=544.9nm，PDI=0.231。

图4 不同体积固化液制备的OA微粒SEM图

编号离心速度与时间平均粒径(nm)PDI14500r/min,50min——24500r/min,30min;5500r/min,30min+10min×4799.00.39236000r/min,50min+10min×4605.50.16548000r/min,30min+5500r/min,10min×4395.50.23859000r/min,30min+5500r/min,10min×4827.50.221

图5 6 500 r/min制备的微粒粒径分布图

2.3.3 水相PVA浓度考察

对水相PVA浓度进行考察，如表4所示。由粒径检测结果可以看出，一定范围内，随着水相PVA浓度的增大，平均粒径及PDI值有减小的趋势，以4%时最好，但是PVA浓度为4%时，粒径检测结果显示三个峰，分布不均匀。综合Z-average和PDI值，当水相PVA浓度为3%时最好。

2.3.4 固化温度考察

加热固化及常温固化考察如表5所示，水相PVA浓度为3%。由试验结果可知常温固化效果不好，推测常温时，溶剂挥发慢，液滴保持液态的时间长，相互之间发生融合的几率高，融合后的液滴体积发生比较大的变化。

表4 不同PVA浓度考察

表5 固化温度考察试验表

2.3.5 固化液种类考察

表6 不同固化液考察

2.3.6 冻干保护剂考察

为减小冻干过程对微粒粒径的影响，需要加入冻干保护剂[6]。通过对比冻干前后微粒混悬液粒径变化，考察不同冻干保护剂对微粒的保护效果，见表7。离心洗涤后每支离心管(含OA60mg)加入2mL冻干保护剂超声分散均匀后冻干。

表7 冻干保护剂对OA微粒粒径的影响

加入葡萄糖和蔗糖组，OA微粒吸湿性很强，黏度很大，不成粉末。而加入乳糖和甘露醇组与不加冻干保护剂组相比，均能降低OA微粒再分散后的平均粒径，说明可以改善OA微粒的分散性。为最大程度降低由于冻干造成的OA微粒团聚，对乳糖和甘露醇的浓度进行考察，如表8所示。以15%乳糖和3%甘露醇为冻干保护剂时，OA微粒的平均粒径较小。15%乳糖为冻干保护剂时，冻干样品表面出现塌陷，因此选择3%甘露醇作为冻干保护剂。

表8 冻干保护剂不同浓度对OA微粒粒径的影响

综上，在油相浓度为0.3%、油相与水相体积比为1∶4的条件下，优选水相浓度3%、过膜后乳液与固化液体积比1∶5、固化液为2.4%PVA+0.9%NaCl、固化温度70℃、以6 500r/min速度离心30min后洗涤4次，每次10min，冻干前加入3%甘露醇制备的OA微粒平均粒径较小，分散较容易。按照此条件进行工艺验证结果如表9，平均粒径(434.7±39.06)nm，PDI(0.25±0.08)。

表9 工艺验证结果

3 讨论

快速膜乳化法被认为是制备单分散乳滴最有效、实用的方法，课题组开发的不锈钢膜已经成功应用于水飞蓟宾PLGA微球[7]和水飞蓟宾微粒[5,8]的制备，本研究采用不锈钢膜首次制备了不含包载辅料的球形齐墩果酸微粒。课题前期研究已经证明膜孔径、水相浓度、油相与水相体积比、过膜压力等是影响微球及微粒平均粒径和粒径均匀度的主要因素，本研究主要对影响齐墩果酸微粒分散性的影响因素进行了探究。研究结果表明，除水相浓度外，固化及干燥过程对OA微粒的分散性均有显著影响。一定范围内，水相浓度越高，微粒的平均粒径越小，PDI越小，分散性越好；固化液中加入适量的电解质可以增大电位，增加乳滴之间的斥力，从而提高乳液的稳定性；固化液体积比增大，可以使乳滴充分分散，减小再团聚的可能；加热固化，可以缩短固化时间，减小液滴融合的几率；冻干时加入合适的冻干保护剂能够有效的防止微粒再次聚集，减小粒径分布跨度，提高微粒冻干粉的稳定性。

目前药物微粉化常用的方法有气流粉碎、胶体磨、球磨等，通常只能将药物粒径加工至25μm以下，只有极少数小于1μm，在该尺度范围内，由于粒子比表面积的增加，可以增大药物的溶出速率，但是药物的溶解度提高并不显著[9]。本实验制备的齐墩果酸微粒可以将粒径控制在1μm以下，实现了微粉化药物向亚微米化药物的发展；同时与常规的微球、微囊制备方法相比，由于不含包载辅料，因此不必考率包封率、载药量以及辅料安全性问题。但是目前制备的OA微粒冻干粉再分散性仍然不能满足注射给药的要求，即冻干粉需要较长时间超声才能分散完全，不能在短时间混悬均匀；并且分散均匀后不能长时间稳定悬浮于水中，容易发生沉降。作者期望通过进一步试验从多方面改善OA微粒再分散性和稳定性问题，为齐墩果酸亚微粉化及新制剂的开发提供一种新的思路。

[1] 田丽婷,马龙,堵年生.齐墩果酸的药理作用研究概况[J].中国中药杂志,2002,27(12):9-11.

[2] 杨桂明,胡志芳.中药药剂学[M].北京:人民卫生出版社,2010:437.

[3] 赵争胜,邢黎明,周彦召,等.齐墩果酸钠盐的制备及其溶解度[J].中成药,1991,13(8):32.

[4]JeongDW,KimYH,KimHH,etal.Dose-linearpharmacokineticsofoleanolicacidafterintravenousandoraladministrationinrats[J].Biopharm.DrugDispos,2007, 28(2):51-57.

[5] 尹雪雁,许凉凉,伊辛,等.均匀与正交设计法优化水飞蓟宾微粒制备工艺的比较研究[J].天津中医药,2015,32(12):752-756.

[6] 赵晓玲.齐墩果酸纳米悬浮液及其冻干粉的制备[D].武汉:华中科技大学,2006.

[7] 戎堃,刘彬丽,李木子,等.不锈钢膜乳化法制备PLGA微球的初步研究与评价[J].中国中药杂志,2014,39(7):1229-1233.

[8] 伊辛,许凉凉,尹雪雁,等.不锈钢膜乳化法制备水飞蓟宾微粒的工艺优化[J].世界科学技术-中医药现代化,2015,17(1):243-248.

[9] 陈亚军.齐墩果酸纳米悬浮液研究[D].武汉:华中科技大学,2005.

Preparation of Oleanolic Acid Particles through Premix Membrane Emulsification

WU Chen-yue, FAN Wen-shuo, TIAN Juan, CAI Cheng-ke*

(SchoolofChineseMateriaMedica,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100102,China)

Objective: To achieve well dispersible, relatively uniform and narrow size distribution Oleanolic Acid (OA) particles without coating materials and to establish a method and optimize the process parameters. Methods: Take Z-average and PDI of OA particles as main indexes, and supplement electron microscope to investigate the factors which may influence the shape and dispersibility of OA particles. Results: Uniform and well dispersible OA particles were prepared by premix membrane emulsification method. The average particle size was (434.7±39.06)nm and PDI was (0.25±0.08). Conclusion: Stainless steel premix membrane emulsification could be used to prepare insoluble component OA particles, and has a promising developmental prospect.

Oleanolic acid;Premix membrane emulsification;Particles

国家自然科学基金面上项目(No.81173562)；北京中医药大学自主选题在读研究生项目(No.2016-JYB-XS102)

吴晨悦(1992-)，女，硕士研究生在读，主要研究方向：微粒给药系统研究。

蔡程科*(1971-)，男，博士，硕士研究生导师，主要研究方向：中药新剂型与制药新技术研究。

2016-09-01

R283.6

A

1002-2406(2017)01-0029-04

修回日期：2016-09-30