齐墩果酸调节HMGB1/TLR4/NF-κB介导的炎症通路减轻蛛网膜下腔出血后的早期脑损伤

韩雨薇，王晨辰，李晓明

0 引言

蛛网膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage,SAH)是一种高死亡率、高残疾率且预后差的脑血管疾病。早期脑损伤(Early brain injury,EBI)是SAH后72 h内发生的脑损伤，是影响SAH预后的主要原因之一。EBI的病理机制复杂，大量文献表明,炎症反应是SAH后EBI发生发展的重要环节之一。

高迁移率蛋白B1(HMGB1)是上游的炎症介质，其过量表达能够加重SAH后早期脑损伤。HMGB1是一种核蛋白，在中枢神经系统中的多种细胞中广泛表达，包括星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞、神经元和内皮细胞[1]。因为SAH患者HMGB1的血浆水平显著高于健康人，故临床上可将HMGB1用于评估SAH后的功能预后和死亡率[2]。细胞外HMGB1可以与Toll样受体-2(TLR2)、Toll样受体-4(TLR4)和RAGE相互作用[3]。TLR4是细胞外HMGB1的主要结合受体。NF-κB是TLR4下游参与炎症反应的重要转录因子[4-5]。TLR4活化后能够促使IκB降解，从而导致NF-κB p65入核，最终产生大量的炎症因子[6-7]。因此，在SAH中，调节HMGB1的表达和释放从而调控HMGB1介导的TLR4/NF-κB炎症信号通路十分重要。

齐墩果酸(3b-hydroxy-olea-12-en-28-oic acid，OA)是五环三萜类化合物，在食品和药用植物中广泛表达，有显著的抗炎和神经保护作用[8]。研究表明，齐墩果酸能够降低脂多糖(LPS)诱导的人脐静脉内皮细胞HMGB1表达[9]。我们的前期研究发现，齐墩果酸能够减轻SAH大鼠的BBB破坏程度[10]。然而，齐墩果酸对SAH引起的炎症反应及其作用机制的影响目前尚不清楚。本研究探讨齐墩果酸是否可以通过调节HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路，从而减轻SAH诱导的炎症，保护早期脑损伤。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 齐墩果酸购买于天津士兰科技有限公司；HMGB1、NF-κB、p65、IκBα抗体购自Cell Signaling Technology公司；TLR4、β-actin购自Santa Cruz公司；细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒，BCA蛋白定量试剂盒，RIPA裂解液及5×loading buffer均购自碧云天公司。

1.2 实验动物和分组 雄性SD大鼠(250～300 g)来源于北部战区总医院实验动物中心。动物饲养于恒温室中，12 h/12 h光暗交替，给予充足食物和水。动物实验严格按照“National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals”标准进行。72只大鼠随机分成3组：假手术组(18只)、SAH模型组(30只)、齐墩果酸给药组(20 mg/kg，24只)。术前禁食，模型完成1 h后给予齐墩果酸，24 h后取材。

1.3 模型建立 SAH大鼠模型建立如之前所述。实验设计如图1所示。

图1 实验设计流程图

1.4 SAH严重性评价和神经功能学评分 根据Sugawara[11]评分标准对SAH的严重程度进行0～3级评分，评分越高表示SAH越严重。根据Sugawara[11]评分标准对大鼠进行神经功能学评分，对6个活动项目进行测试，并给予0～3分的评价。总评分越低则说明神经功能损伤越严重。

1.5 脑组织含水量测定 24 h后，取脑组织，切分为小脑和左右半脑3部分，擦干称重后，于110 ℃烘箱中72 h烘干，然后称重，按照公式脑含水率(%)=(湿重-干重)/湿重×100%计算。

1.6 脑血管通透性测定 取材1 h前，2%伊文思蓝溶液(5 ml/kg，尾静脉注射)，1 h后生理盐水灌注，取出脑组织，切分为小脑、左右半脑分别称重。将组织浸润到甲酰胺溶液中，60 ℃恒温孵育24 h后收集浸出液，酶标仪620 nm处测定OD值。

1.7 细胞核、细胞浆蛋白提取 取各组脑组织切成非常小的碎片，按照细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒说明书步骤进行操作。

1.8 Western blot检测蛋白表达 取脑组织称重，加入1 ml裂解液，匀浆裂解30 min，4 ℃，12 000 r/min离心10 min后取上清；BCA法测定蛋白浓度，加入5×loading buffer，100 ℃煮沸5 min；10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，每孔加入40 μg总蛋白样品；5%脱脂牛奶室温封闭1 h；一抗HMGB1(1∶500)、p65(1∶500)、IκBα(1∶500)、TLR4(1∶200)、β-actin(1∶1 000)4 ℃过夜；1∶8 000稀释二抗，温孵育1 h；Pro-light HRP发光试剂盒检测，用X-ray显影。

2 结果

2.1 齐墩果酸对SAH后早期脑损伤的影响 如图2A、图2B所示，与假手术组相比，SAH模型组出血严重，SAH评分明显增高，齐墩果酸(20 mg/kg)给药能够显著减少出血量，降低SAH评分(P<0.001)。齐墩果酸可以抑制SAH导致的体重降低(P<0.05，图2C)。根据神经行为学评分标准，我们对手术24 h后的大鼠进行行为学评分。结果表明，SAH模型组神经行为学评分显著降低，神经损伤严重，而齐墩果酸(20 mg/kg)给药能够显著提高神经行为学评分，改善神经功能(P<0.01，图2D)。同时，我们检测了脑水肿和通透性的变化，发现与SAH模型组相比，齐墩果酸能够显著降低脑含水量和伊文思蓝的渗出率，提示齐墩果酸对脑血管屏障具有显著的保护作用(P<0.01，图2E、图2F)。

图2 齐墩果酸给药对蛛网膜下腔出血24 h后SAH评分(A、B)、体重(C)、神经功能损伤(D)、脑含水量(E)和伊文思蓝渗透率(F)的影响

2.2 齐墩果酸对SAH后HMGB1的影响 如图3所示，对全细胞、细胞浆和细胞核中HMGB1蛋白含量均进行了检测，结果发现，在SAH组其蛋白含量均显著增加(P<0.01)。与SAH组相比，齐墩果酸能够明显降低HMGB1在全细胞(P<0.01)和细胞浆(P<0.001)中蛋白表达，而在细胞核中无显著变化。以上实验结果说明，齐墩果酸给药能够抑制HMGB1的表达和释放。

图3 齐墩果酸对SAH后HMGB1蛋白在全细胞(A)、细胞浆(B)和细胞核(C)中的影响

2.3 齐墩果酸对SAH后HMGB1介导的TLR4/NF-κB炎症通路的影响 在SAH模型组中TLR4表达增加，IκBα降解，IκBα降解使NF-κB激活促进p65转位入核。齐墩果酸给药能够显著减少TLR4的表达，抑制IκBα降解，减少p65入核(P<0.01，图4)。

3 讨论

早期脑损伤是SAH高死亡率的关键环节之一。SAH后早期脑损伤的病理机制十分复杂，其中越来越多的证据表明，炎症是参与早期脑损伤的主要机制之一。在SAH后，大量的炎性细胞因子和趋化因子释放，从而引起脑水肿和神经系统损伤[12]。因此，抑制炎症反应是治疗SAH后早期脑损伤的重要途径。

研究表明，SAH会引起脑组织中HMGB1的转位和释放[2,4]。释放的HMGB1能够与细胞膜表面的TLR4受体结合，然后激活NF-κB信号通路、促进大量炎症因子的产生[13-16]。齐墩果酸对SAH中HMGB1表达及HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路的影响仍未见报道。在本研究中，我们发现齐墩果酸能够显著抑制HMGB1的表达，并且明显抑制其在细胞质中释放。TLR4激活IκB降解导致NF-κB活化，p65从细胞质转移入核促进炎性因子TNF-α的产生[17]。我们的研究结果表明，齐墩果酸能够有效抑制SAH诱导的TLR4表达、IκB降解以及p65入核。

图4 齐墩果酸对SHA后HMGB1介导的TLR4/NF-κB信号通路激活的影响

综上所述，齐墩果酸能够降低HMGB1的表达和释放，抑制HMGB1/TLR4/NF-κB炎症通路，改善SAH后的炎症情况。本研究为齐墩果酸治疗SAH后的早期脑损伤的作用及其机制提供了新的参考依据。