齐墩果酸抗肺癌作用及其机制研究进展*

池嘉栋 ，顾鹏飞 ，马炜柯 ，赵杰 ，郑向前 ，高明 ，3

（1.甲状腺颈部肿瘤科，天津医科大学肿瘤医院，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市肿瘤防治重点实验室，天津 300060；2.骨科，天津市天津医院，天津大学，天津 300211；3.乳腺甲状腺外科，天津市人民医院，天津 300121）

在全球范围内，肺癌对人类健康带来的威胁愈发显著[1-2]。尽管随着研究的深入，人们对肺癌的诱因、发生发展过程、致病机制和治疗方案选择有了较深入的认识，但其发病率和病死率依然高居不下。根据细胞分化程度以及形态特征，肺癌常分为小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC）两类。非小细胞肺癌具体分为鳞癌、腺癌和大细胞癌3类[3]。非小细胞肺癌在所有类型肺癌中发病率最高，约占全部肺癌患者的80%。其极易发生转移至远端脏器，患者的生存期较短[1]。

齐墩果酸又名庆四素，是一种五环三萜类化合物，由英国化学家FB Powers首次从木犀科植物中发现并分离获得，后由Ruzicka确定了其结构[4]。其广泛存在于木犀科、龙胆科、五加科等植物，以及苦丁茶、葡萄皮等食物的表皮膜中，可形成一种特殊的蜡质结构屏障，抵御病原体和水分流失。除了防护作用外，齐墩果酸还具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗糖尿病、抗微生物等药理作用，并且其抗癌作用已在多种癌症中得到验证，如肝癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、肺癌等[5-7]。现根据文献将齐墩果酸抗肺癌作用及机制综述如下。

1 齐墩果酸的提取、分离和表征

齐墩果酸的提取方法包括索氏提取法、超声辅助提取法、微波辅助提取法等[5-6]。薄层色谱（TLC）、高效液相色谱（HPLC）和核磁共振（NMR）常用于齐墩果酸的表征和鉴定[5，7]。齐墩果酸的分离通常需要用非极性溶剂（如正己烷、石油醚等），随后利用沉淀及结晶、真空液相色谱和柱层析等技术分离。溶剂的选择、萃取溶剂的浓度、溶剂与植物物质的比例、温度、萃取时间等因素也会对齐墩果酸的提取和分离效率产生影响[8]。

2 齐墩果酸抑制肺癌的作用机制

齐墩果酸抑制肺癌主要通过直接和间接两个途径来发挥作用。肺癌的主要发病机制包括细胞凋亡异常以及细胞周期失控等。细胞凋亡是由多种因子参与介导并最终导致细胞死亡的过程。多项研究表明，肺癌与细胞凋亡异常密切相关，线粒体、死亡受体、内质网及溶酶体介导的细胞凋亡过程在肺癌中均具有重要作用[9]。细胞周期失控会引起肺癌细胞异常复制增殖，伴随新生血管的异常形成，共同组成肺癌发生发展过程中的重要特征。此外，免疫系统也在其中扮演着重要的角色。探讨齐墩果酸在肿瘤发展不同环节的作用及机制，有望为肺癌的临床治疗提供新思路和新方向[10-11]。

2.1 抑制肺癌细胞增殖 在小鼠皮下荷瘤模型中，治疗组每日予以口服齐墩果酸（低剂量组 40 mg/kg；高剂量组 120 mg/kg）。结果显示高剂量组瘤体积（600 mm3）显著低于低剂量组（1 500 mm3）和对照组（2 200 mm3），表明齐墩果酸可以抑制肿瘤的生长[12]。Matsunaga等[13]报道了一项9，10-菲醌对于肺癌影响的体外实验研究，发现9，10-菲醌能通过醛酮还原酶1-B10促进肺癌细胞的生长。而齐墩果酸是醛酮还原酶1-B10的拮抗剂。在3D细胞培养模型中，齐墩果酸能显著抑制9，10-菲醌的促癌作用，联合齐墩果酸组的肿瘤体积仅为单纯菲醌组的1/3。此外，研究发现齐墩果酸呈时间及剂量依赖性抑制A549，NCI-H460和NCI-H1299等肺癌细胞的增殖能力。结果表明齐墩果酸抑制PGCL3细胞的IC50为44.73 μmol/L，在该浓度条件下，集落形成抑制率为61.6%。CCK8实验表明齐墩果酸干预Bel-7402细胞48 h后能够抑制肿瘤细胞增殖速率[14]。总体而言，齐墩果酸通过抑制肺癌细胞的增殖能够发挥显著抗肿瘤作用。

2.2 诱导肺癌细胞凋亡 肿瘤细胞的凋亡过程与正常细胞存在很大差异。诱导肿瘤细胞凋亡进而抑制其发展及转移是目前肿瘤研究的热点之一[15]。研究发现齐墩果酸处理非小细胞肺癌后，凋亡相关蛋白半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）的活性显著升高[16]。齐墩果酸可通过多个作用靶点同时调控不同信号通路与生物学过程从而诱导细胞凋亡，其中包括细胞内钙离子水平、NF-κB信号通路、Notch信号通路、JAK/STAT3信号通路、B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）家族蛋白、线粒体功能、细胞色素C释放以及核糖聚合酶的表达等[17]，具体作用机制如下。

2.2.1 调节胞内钙离子水平 钙离子在生物体内发挥着重要的作用，参与人体内各项生理活动，维持细胞的膜电位并参与神经电信号传导[18-19]。通常认为细胞内游离钙离子（Ca2+）浓度的持续升高是凋亡的启动环节之一[20]。黄炜等[21]研究发现，与甘草酸、甘草次酸相比，齐墩果酸处理肺癌细胞PGCL3 48 h后，细胞凋亡率升高到61.6%，具有显著统计学差异，因此齐墩果酸具有诱导细胞凋亡的作用。卫小红等[22]用梯度浓度齐墩果酸处理A549细胞后，检测胞内钙离子浓度及细胞凋亡率改变。结果显示随着齐墩果酸浓度升高，胞内Ca2+浓度随之显著升高。相关分析结果表明细胞凋亡率与胞内钙离子浓度具有相关性（R2＝0.981，P＜0.01）。Ca2+作为第二信使参与细胞凋亡早期和晚期的全过程，和Capase-3酶的激活也密切相关。有研究报道，当NCIH446肺癌细胞内 Ca2+浓度为（202.18±21.20）μmol/L 时，凋亡相关基因间变性淋巴瘤激酶（ALK）、KARS、Bax、Bcl-2表达均显著升高[23]。

2.2.2 影响Bcl-2/Bax蛋白的表达 细胞凋亡受多种蛋白调控，其中Bcl-2家族起着至关重要的作用[24]。Bcl-2具有明显抑制细胞凋亡的作用，位于细胞线粒体和内质网膜中[25]。研究表明，大细胞肺癌患者肿瘤组织Bcl-2基因表达显著升高，并且其高表达和不良预后相关[26]。Feng等[27]从夏枯草中分离得到了齐墩果酸，将其与肺腺癌SPC-A-1细胞共同孵育，发现细胞凋亡率和齐墩果酸呈现剂量依赖性关系，证明齐墩果酸可以诱导SPC-A-1细胞的凋亡。后续机制研究发现齐墩果酸能够诱导癌细胞Bax和Bad高表达，并抑制Bcl-2蛋白的表达。这些结果表明齐墩果酸能通过影响Bcl-2家族蛋白的表达促进肺癌细胞的凋亡。

2.2.3 调控NF-κB信号通路 NF-κB是一个具有多个作用靶点的转录因子[28]。朱斌等[29]的研究表明，OLO2（一种新型齐墩果酸衍生物）在人肺腺癌细胞A549中的 IC50约为（1.96±0.41）μmol/L，OLO2治疗后显著提高了肿瘤细胞凋亡水平。OLO2联合顺铂治疗能显著降低NF-κB基因的表达。从表观遗传学的角度来看，齐墩果酸能够显著抑制小鼠肺组织中NF-κB的乙酰化修饰水平，从而特异性调控靶基因的表达[30]。将齐墩果酸衍生物SZC015与非小细胞肺癌H322细胞共孵育后，细胞凋亡率显著上升。在这个过程中，0、10、20、30 μmol/L SZC015 梯度浓度处理后，下游促凋亡蛋白cleaved Caspase-3和cleaved Caspase 9的表达呈现剂量依赖性升高。同时Akt等保护性基因表达呈现递减趋势[31]。这些研究表明齐墩果酸可以通过干扰NF-κB信号通路相关分子诱导肺癌细胞的凋亡。

2.2.4 调控JAK/STAT3信号通路 STAT3信号通路在非小细胞肺癌的发生发展中起着重要的作用[32]。在晚期肺癌患者中，大约50%存在STAT3信号的过度持续激活。STAT3的激活受细胞内激酶的精确调控，如Janus Kinase等[33]。在非小细胞肺癌中，由于JAKs等激酶的功能异常，导致STAT3过度活化并发生核转位，进而与细胞核内DNA结合，最终导致肿瘤的发生[34]。因此，抑制STAT3向核内转移可能是治疗肺癌的一个有效策略。Tang等人利用肺癌细胞A549进行实验，发现齐墩果酸干预后细胞凋亡率显著增加。机制研究表明齐墩果酸可以诱导肿瘤细胞内生成大量ROS，ROS能够抑制Akt和JAK2/STAT3信号，降低JAK2和STAT3的磷酸化水平，进而阻止STAT3核转位，最终促进肺癌细胞的凋亡。

2.3 影响细胞周期

2.3.1 调控miR-122/cyclin G1/MEF 2D轴阻滞细胞周期 齐墩果酸调控细胞周期的机制主要是通过影响miR-122/cyclin G1/MEF 2D通路，引起细胞周期停滞[35]。许多研究表明，miRNA是肺癌进展中一类重要的调控因子，与肺癌的发生发展及转移有着密不可分的关系，而中药活性单体齐墩果酸可以特异性调控靶标miRNA的表达[12]。Zhao等[12]研究发现齐墩果酸在鼠源鳞状上皮细胞LC-1及小鼠原发性肺癌中，能够上调转录因子HNF-6和HNF-1α的水平从而促进miR-122的表达，进而抑制其下游分子cyclin G1以及MEF 2D的表达，使癌细胞停滞在G0/G1期，降低肺癌细胞的增殖率。齐墩果酸能使A549细胞增殖速率明显下降，该抑制作用具有时间和浓度依赖性。此外，在活体水平齐墩果酸也能诱导miR-122表达增加。因此，齐墩果酸能够影响miR-122/cyclin G1/MEF 2D通路导致细胞周期停滞，进而抑制肺癌细胞的增殖和扩散。

2.3.2 调控cyclin B1/cdc 2阻滞细胞G2/M期 丝裂原活化蛋白激酶的激活与细胞周期阻滞密切相关，有研究表明齐墩果酸可以显著增加ERK的磷酸化水平，因此齐墩果酸可能通过该方式影响细胞周期。细胞周期的G2/M期进程是由成熟促进因子（cyclin B1/cdc 2复合物）驱动。Wang等[17]将齐墩果酸与肺癌细胞A549孵育后，发现G2/M期的细胞含量升至60%，远高于对照组的15%。在齐墩果酸的作用下，G2/M期过渡检查点cyclin B1和cdc2表达量显著降低。另一方面，p21表达量却显著升高。已知p21是一种促进细胞停留在G2/M期的蛋白。因此，齐墩果酸作用于肿瘤细胞后，可以增加ERK磷酸化水平以及p21蛋白表达，抑制cyclin B1/cdc 2复合物的合成，将细胞周期阻滞在G2/M期，从而有效干扰肺癌细胞周期过程。

2.4 诱导肿瘤细胞的自噬 自噬是一种依赖溶酶体的自我降解途径。一般认为发生在肿瘤细胞的自噬起到自我保护作用，但是过度的自噬会起到抑癌作用。一项在A459细胞中的研究表明，20 μg/mL浓度的齐墩果酸干预A459细胞48 h后，细胞自噬标志物LC3-II的表达明显增加，同时伴随线粒体结构发生明显改变，主要表现为线粒体肿胀，并可见大量碎片。另一项针对A459细胞的研究表明，SZC017（齐墩果酸衍生物）能够诱导LC3-II及Beclin-1的表达呈剂量依赖性升高，并可观察到大量自噬体[36]。同时，齐墩果酸干预后细胞自噬调节因子PINK 1/Parkin的mRNA及蛋白表达水平均显著升高[37]。另一方面，齐墩果酸对于自噬的影响和细胞凋亡/增殖密切相关。氯喹作为自噬抑制剂，干预H322细胞后，pro-Caspase 3及LC3的表达明显升高。这提示一定程度的抑制自噬可以促进肿瘤细胞凋亡并抑制其增殖[31]。

2.5 调控肿瘤微环境

2.5.1 抑制肿瘤血管新生 血管生成是肿瘤发生、发展过程中的重要环节[38]。其中VEGF在血管生成中起主导地位[39]。牛国平等[39]研究了齐墩果酸对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）增殖、侵袭和迁移能力的影响，结果表明齐墩果酸能够有效抑制HUVECs的迁移能力。此外，齐墩果酸可以在体内水平阻断VEGFR磷酸化、抑制MEK/JNK通路激活，从而抑制肺癌的血管生成过程并降低其通透性，最终抑制肺癌细胞的扩增和转移。

2.5.2 调控肿瘤免疫反应 免疫反应是影响癌症发展的重要因素之一。通过调节肿瘤微环境，间接对肿瘤进行免疫调控是最新的研究热点。齐墩果酸能够显著提高小鼠巨噬细胞的吞噬能力及T淋巴细胞的免疫功能。在荷瘤小鼠体内，齐墩果酸可以增加NK细胞的数目，并且可以促进其分泌白介素（IL）-2因子，增强对肿瘤细胞杀伤能力[40]。在肺癌临床治疗中，基于PD-1/PDL-1的免疫治疗策略受到越来越多关注。在A549与T细胞共培养模型中，齐墩果酸能够显著促进T细胞分泌IL-2，同时增强T细胞对A549细胞的杀伤作用[41]。研究证明齐墩果酸可以提高肿瘤微环境中促炎因子IL-1β的含量，从而有效提升抗原提呈作用，抑制肿瘤细胞的生长和转移[41]。

3 齐墩果酸的衍生物及新剂型

齐墩果酸具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒等药理活性，但其多环刚性结构又使得齐墩果酸具有水溶性差、生物利用度低、毒性大、药理活性弱等缺点，严重影响了其疗效。为了改进这些缺点，研究人员以齐墩果酸母环结构为模板来进行结构修饰，可以显著提高齐墩果酸的水溶性和生物利用度，为新药的开发奠定了基础。目前齐墩果酸衍生物主要是在C-3羟基、C-12/C-13双键和C-28位羧基上进行功能化修饰[42]。新剂型主要包括纳米颗粒、脂质体、固体分散体和磷脂复合物制剂等。通过对齐墩果酸进行结构修饰以及剂型优化能够显著提高其水溶性和生物利用度等[43]。

3.1 酯类/氮杂环类衍生物 以齐墩果酸为前体化合物，通过酯化、氧化还原、缩合等反应，合成齐墩果酸磷脂类化合衍生物，通过MTT实验发现，该化合物抑制肺癌的能力较原齐墩果酸有着显著性的提高，同时其安全性也有很大的提升[44]。此外，以齐墩果酸为先导化合物，通过氧化还原反应得到氮杂环衍生物QDGS-6。体内外活性检测表明，QDGS-6的活性相较于单纯齐墩果酸具有明显的提高，在细胞水平上的安全性更高，在有效抑制肺癌细胞A549增殖的同时，生物毒性更低[45]。

3.2 胶束包合物 胶束可以提高齐墩果酸的溶解度、生物利用度等[46]。研究发现利用薄膜分散法制备了齐墩果酸胶束，并对其进行表征及体内外释放效率的验证。体外释药结果表明，包含游离齐墩果酸的透析袋在24 h释药约为80%，然而齐墩果酸胶束仅为40%左右，因此可以达到缓释目的。此外，齐墩果酸胶束对A549和PC-9细胞的抗肿瘤效果要明显高于游离齐墩果酸。体内实验结果证明齐墩果酸胶束可显著减小肺癌肿瘤体积，抑制肿瘤的侵袭、迁移[47]。所以，齐墩果酸聚合物胶束是一种很有前途的纳米药物递送系统，为肺癌的临床治疗提供了新的理论基础和技术策略。

4 结论与展望

齐墩果酸可通过多种途径抑制肺癌，对肺癌细胞的增殖、转移和侵袭均具有一定的抑制作用。目前临床上对肺癌的非手术治疗大多依靠放疗、化疗、靶向治疗及免疫治疗等，然而放化疗严重的副作用及不良反应依然是不可避免的，相对而言，齐墩果酸等中药单体在副作用及不良反应上有着明显优势，且随着研究深入，化学合成的齐墩果酸衍生物及新剂型能够显著提高其水溶性和生物利用度，强化抗肿瘤效果的同时保证生物安全性。因此，未来进一步结合中医学、化学、医学、生物学等多学科技术制备可以精确、高效靶向肿瘤部位的齐墩果酸新制剂，有望为肺癌的临床治疗提供新的策略和方向。