浅析外泌体参与针刺调节作用的特点分析*

王美娟 ，李柠岑 ，陈波 ，2，3，陈勇 ，杨克俭 ，张靖宇 ，单凯 ，陈泽林 ，2，3，郭义 ，3，4

（1.天津中医药大学实验针灸学研究中心，天津 301617；2.天津中医药大学针灸推拿学院，天津 301617；3.国家中医针灸临床医学研究中心，天津 300381；4.天津中医药大学中医学院，天津 301617）

针灸是中医的重要组成部分，也是世界卫生组织（WHO）认可的安全高效疗法，目前已在世界近200个国家和地区使用，可治疗百余种病种[1]。不同于西药单一靶向的耦合反应，针灸疗法可从整体层面和宏观角度来调节机体状态，产生广泛而长远的疗效。针灸作为一种良性应激源刺激，具有不同于药物的特点，它不是“点-点”直接针对病原体及患病的组织器官，而是通过启动内源性自稳调控系统“神经-内分泌-免疫网络”（NEI network）对机体发挥多水平、多系统、多靶点的调节作用。

过往针灸基础研究多关注于“干预-效应”两点之间的线性关系，忽略针灸作为复杂干预产生的整体网络调节作用，严重制约了针灸学科的发展，使得基础研究与临床应用脱节，针灸科研成果转化不足。

外泌体是一种由细胞释放的直径约30～200 nm的膜性囊泡，作为机体网络联系的重要载体与运输方式，可以参与机体多种生理病理过程[2-3]。前期通过实验研究[4]发现，针刺可调节外泌体释放，且外泌体与针效之间存在密切关系，外泌体作为神经、内分泌、免疫细胞间相互通讯的重要载体，可能在针刺网络调节中发挥重要作用。对外泌体的特点进行总结分析，发现外泌体来源分布广、运载物质多、产生效应多，并可靶向与细胞结合，运载与疾病相关的靶标物质，临床应用安全稳定，可能与针刺作用密切相关[5]。它独特的生理学结构与功能，在针刺信息传递中具有很多优势，为实现针刺信息在体液途径远距离、精准靶向传递提供了生物学基础。因此笔者从外泌体入手，探究其生物学功能，整理分析外泌体与针刺作用特点的相关性，以期更好地揭示针灸作用机制和促进临床转化。

1 外泌体可能是针刺整体及网络调节的重要载体

外泌体于1987年由Johnstone首次在成熟的哺乳动物网织红细胞中发现[6]。几乎所有活细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体，如间充质干细胞、肿瘤细胞、巨噬细胞、树突状细胞、肥大细胞、人羊膜上皮细胞、内皮祖细胞等不同类型的细胞[7]。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷而形成的多囊泡体，在多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中，且外泌体在体液中的分布十分广泛，研究发现[8-10]唾液、心包积液、乳汁、尿液、腹水、羊水、脑脊髓液和血液等多种体液中都存在着外泌体。外泌体运载物质种类丰富，包含有蛋白质如细胞骨架蛋白、信号转导相关蛋白、代谢酶类、抗原结合提呈相关蛋白等共9 769种，核酸组分mRNA、miRNA、IncRNA、mtRNA、circRNA 等6246种，脂质组分如鞘磷脂、磷脂类、神经酰胺和三酰甘油等共1 116种[11]。以肥大细胞为例，仅肥大细胞来源的外泌体就可以运载高达1 988种蛋白质，397个lncRNA和272个miRNA[12]。

整体性是中医核心理论整体观念的具体表现，针灸作用也具有整体性的特点，临床研究和动物实验表明，针灸可以调整呼吸、消化、循环、泌尿、神经、内分泌、免疫等各系统的异常功能，针灸对某一脏器的调整作用是通过对该脏器所属系统甚至全身系统功能多层次、多水平的总体调节而实现的，从穴位至全身，由点及面，通过刺激体表腧穴达到调节机体整体状态的作用[13]。针灸作用于穴位后，首先激活针灸穴位微环境小网络，使针灸信息在穴位局部启动并级联放大，进而调动人体自身调节大网络——NEI network，经调控，针灸效应信息输出到靶器官，调整疾病网络，产生针灸疗效，三网联动，纠正疾病的失衡状态，恢复机体的内稳态，达到“中和”状态[14]，产生针灸的整体调节作用。以NEI network为基础的经络网络调控系统是人体维持自稳态的生物学基础，是机体网络调节的核心环节。神经系统是经络系统的核心部分，同时还涵盖了包括血液、淋巴、内分泌、免疫等等多系统的内容，是由多系统构成的一个多水平、多层次、多靶点的网络体系。

着眼于脏腑功能的整体变化，而生命活动的内在本质是细胞活动，整体宏观与微观局部密不可分，微观的动态变化也往往反映整体的变化。外泌体产生异常的蛋白质、分子等靶基因，提示人体内部微环境发生动态变化，进而表现出不同的症状。外泌体无所不在、无处不去的普适性特点也可能为针刺穴位信息的广泛性提供一定支撑，如外泌体可携带多种靶向物质以血液、淋巴循环等方式到达肝脏、脾脏等多个脏器发挥相应的治疗作用。同时以电针足三里穴治疗佐剂性关节炎大鼠为研究平台[15]，重点关注血清外泌体及内含物的变化，以神经内分泌网络为切入点，以蛋白组学为重要手段，从总体上把握疾病状态针刺前后血清外泌体及其内含物的整体变化情况，抓两头看中间，结合海量的蛋白组学数据以及复杂网络分析筛选出针刺后关键信号蛋白和重要通路，探讨电针治疗佐剂性关节炎镇痛抗炎的作用规律[16]。同时发现针刺血清外泌体运载蛋白存在时效、量效差异变化，可能作为具有潜在的针灸广谱性效应物质，产生小刺激、大反应的效应。外泌体及其内含物质作为神经、内分泌、免疫等细胞间相互通讯的重要载体，可能在针刺信号传导过程中发挥重要作用，为针刺的整体、网络调节提供生物学基础。

2 外泌体的靶向运输为针刺的“气至病所”提供生物学基础

外泌体在生物体中的细胞间交流发挥重要作用，其所携带的大量蛋白质、脂质以及核酸等生命信息需遵循生物体运行的有序性，否则会导致信息传递的错乱，破坏生物体内平衡，故外泌体在体内的运输具有一定的靶向性[17]。研究表明，在外泌体表面有一种“邮政编码”—整合素，可以使外泌体去特定器官进行累积，改变其微环境进一步在相应部位发生转移[18]。现代研究发现不同细胞分泌的外泌体拥有不同的整合素类型，从而在运输过程中靶向不同的器官，影响特定器官转移前微环境的形成，因此外泌体可能具有天然的靶向特定组织的特性，并且可以通过修改其生产细胞系重新改变其选择性。如研究发现肿瘤可以向肝、肺等其他器官转移，原因在于外泌体表面有不同的整合素，ITGα6β4及ITGα6β1这类整合素倾向于肺内组织移动，引起组织器官内蛋白水平的变化，产生炎症反应，使成纤维细胞和间质细胞分化，重塑细胞外基质，诱导上皮间质转化，引发血管生成，促进肿瘤的生长和转移[19]。

现代研究发现，针刺可使肿瘤化疗药物导航聚焦，黄金昶团队[20]发现针刺疗法联合紫杉醇在干预后能够调节肿瘤微血管和微环境，使小鼠后瘤体紫杉醇浓度显著增加，诱导肿瘤细胞凋亡。有学者提出可以运用针灸“靶向”思维辅助治疗肿瘤或肿瘤相关症状，针刺穴位以引导化疗药物趋向靶病灶、调节预防和治疗癌后的不良反应等[21]。针刺还可“以针促药”治疗皮肤损伤，台湾大学研究所发现在治疗大鼠糖尿病的皮肤伤口时，在伤口上用一种水凝胶生物材料联合在伤口周围针刺可使其达到（90.34±2.30）%的伤口闭合率，针刺通过激活补体C3a和补体C5a，增加细胞因子基质细胞衍生因子-1（SDF-1）和转化生长因子-β1（TGF-β1）的分泌，以及下调促炎细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素（IL）-1β，改善局部微环境，提高药物利用率，从而加速组织再生，促进伤口愈合[22]。本团队前期[23]通过非标定量法蛋白组学技术对针刺血清外泌体内含蛋白的分泌细胞或组织来源进行分析，发现这些蛋白主要存在于血浆、炎细胞、关节滑液、脑脊液、腺体组织和肌肉中，在病变部位表达含量的增加，可能与外泌体这一特性有关，推测外泌体可使关节局部微环境发生改变，以病变局部为需求，针刺有效成分靶向性移动，而“气至病所”。同时外泌体是具有磷脂双分子层结构的囊泡，其脂质密封结构可以保护相关信号分子在体内传递过程中不被降解，为远距离靶向运输提供稳定的生物学结构基础，同时能保证外泌体在针刺信息传递过程中，将针灸刺激信号更加完整的传导到网络系统中，使针灸作用充分被机体调整和利用，实现远距离靶向运输[24]。

3 外泌体运载的特异性分子为脏腑-经穴相关提供研究思路

来源于不同的组织或细胞的外泌体有不同遗传物质，其膜蛋白也有一定特异性，在实现细胞间信息交流的同时，同时也可间接反映母体细胞所属器官和系统的生理病理状态。如Laulagnier等[25]在肥大细胞分泌的外泌体中首先发现了具有肥大细胞特征的脂质。外泌体miR-301a在神经胶质瘤患者血清中表达升高，其升高程度与胶质瘤的病理分级具有相关性，反映了胶质瘤患者的肿瘤状态和病理变化，提示血清外泌体miR-301a表达可作为胶质瘤诊断的新新型生物标志物，并作为晚期病变的预后因素[26]。另外结肠上皮细胞来源的外泌体膜表面多为A33蛋白，抗原提呈细胞来源-T细胞产生的外泌体表面多为MHCI、MHC-Ⅱ、CD86蛋白[27]。

“脏腑-经穴相关”为内脏器官生理或病理性的改变，可在体表有所反应；外界环境改变或人为刺激体表某些部位或穴位，也能引起相关内脏功能的改变，从而起到治疗和调整作用。外泌体可携带特异性生物信息分子，全身广泛分布，既能反映机体生理和病理的变化，又能作为治疗疾病的靶点，与“脏腑-经穴相关”相似。如马荣丽等[28]认为随着肾功能的改变，由不同肾细胞分泌其外泌体，执行不同的生物功能来调控骨组织。每种外泌体都带有特定的区分标志物，能靶向特定的位点，从多个方面分析“肾主骨”理论外泌体相关指标，认为这些指标可能是“肾主骨”理论的物质基础，反映整个脏象功能。

4 针刺血清外泌体可为针刺基础研究临床转化提供思路

外泌体自体分泌，免疫原性反应低，是一种安全稳定的药物载体，同时还具有器官特异性分布的靶向特点，使得其向细胞的渗透能力提高，在提高药物的利用度、延长药物作用时间、实现药物靶向定位以及降低药物毒副作用等方面有一定潜在应用价值。与基于脂质体和基于聚合物的外源性药物载体相比，外泌体由自体活细胞分泌，在生物相容性、免疫原性、稳定性、药代动力学、生物分布和细胞摄取机制等方面显示出许多优势，是天然的转运体，适于重复多次给药，且不会造成治疗性物质在肝脏的累积。且外泌体能将携带的遗传物质直接传递进入细胞，有效避免被网状内皮系统识别和清除，避免其在细胞外环境中被清除。目前，全球数十家公司正在研究开发改造外泌体的新技术，且已开始使用纯净的外泌体产品和工程化的外泌体产品进行临床试验。

外泌体在临床上应用也逐渐广泛，上海交大附属医院证实来自富血小板血浆的外泌体在糖尿病大鼠中通过激活YAP促进慢性皮肤伤口的上皮再形成[29]；在BALB/c小鼠的全层皮肤缺损伤口上，经血清外泌体处理后，小鼠伤口愈合可加快[30]。课题组前期研究发现对脓毒症小鼠注入外泌体拮抗剂GW4869，抑制了电针治疗脓毒症小鼠的疗效[31]，回输正常小鼠电针后的血清外泌体，可产生“针刺样”作用。腹腔回输正常大鼠电针后的血清外泌体对佐剂性关节炎大鼠也明显的镇痛效应[32]，提示血清外泌体可作为一种生物制剂进行开发研究。

5 小结

外泌体分布广、来源广、运载物质多、产生效应多、靶向运输、组织来源特异性、临床应用安全稳定等特点，可能与针灸整体网络调节、“气至病所”、脏腑-经穴相关、针灸血清药转化应用等特点密切相关。在针刺多水平、多途径、多靶点的调节过程中，外泌体及其运载物质可能是重要的物质基础，充分利用高通量组学技术与方法进行研究是打开针刺起效机制的重要途径。但目前对于外泌体参与针刺调节的机制仍有待探索。针灸刺激会产生双向良性调节，能对生理病理过程功能产生反向调节，所产生的效果取决于机体本身的表现，外泌体是否以及如何参与其中尚不清楚。以及网络调节是针灸作用的最主要特点，虽然肯定了外泌体可能参与NEI network调节过程，但其作用机制是什么未来还需要进一步研究。来源于针刺血清外泌体的新药发现与开发策略，可能为探索出从实验室到临床的转化医学模式，促进临床疗效最大化，提高针灸应用水平提供有力证据。