HPLC法同时测定杜仲叶中4种成分的含量

王学军，梁旭华，徐恒

(陕西省商洛学院生物医药与食品工程学院，陕西 商洛 726000)



HPLC法同时测定杜仲叶中4种成分的含量

王学军，梁旭华，徐恒

(陕西省商洛学院生物医药与食品工程学院，陕西 商洛 726000)

目的：建立高效液相色谱法同时测定杜仲叶中4种成分含量的方法。方法：采用C18色谱柱(200mm×4.6mm，10μm)，以甲醇-0.1%磷酸溶液为流动相，梯度洗脱(甲醇：0～2min，22%；2～6min，22～60%；6～20min，60%；20～24min，60～22%；24～28min，22%)；流速0.8mL/min；柱温30℃；检测波长绿原酸为327nm，芦丁、槲皮素、山奈酚为360nm。结果: 绿原酸、芦丁、槲皮素、山奈酚进样量分别在16.4～98.4μg/mL，15.6～93.6μg/mL，15.18～91.07μg/mL，15.7～94.2μg/mL范围内线性关系良好，平均加样回收率分别为101.0%、98.6%、102.9%、103.3%。结论：建立的方法符合方法学验证要求，可用于杜仲叶中绿原酸、芦丁、槲皮素、山奈酚4种成分的含量测定。

杜仲叶；绿原酸；芦丁；槲皮素；山奈酚；高效液相色谱法

杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)是我国特有的名贵中药材，传统以树皮入药,但树皮资源十分有限，难以满足临床的需求，研究发现，杜仲叶与皮含有相似的药用有效成分，如黄酮类、苯丙素类、木脂素类和环烯醚萜类等，而且药理作用基本一致，均具有降血压、降血脂、抗衰老、抗癌防癌、利尿、安胎等作用[1]，作为中药材杜仲叶在2010版、2015版《中国药典》中均有收载[2]。但《中国药典》2015版仅通过测定绿原酸一种成分含量的方法来控制杜仲叶的质量，难以全面地反映药材的整体质量。本文在参考前人研究的基础上[3-4]，建立了直接测定杜仲叶中绿原酸、芦丁和水解后测定槲皮素、山奈酚4种成分的定量分析方法，提高了杜仲叶的质量控制标准，为杜仲药材及其制剂的质量控制奠定基础。

1 仪器与材料

HH-6型电热恒温水浴锅(北京科伟永兴仪器有限公司)；DHG-9123A型电热恒温鼓风干燥箱(上海齐欣科学仪器有限公司)；LC-20A型反相高效液相色谱仪(四元泵，自动进样器，DAD检测器)(岛津企业管理(中国)有限公司)。

芦丁对照品(批号080-9002,质量分数≥98%)、槲皮素对照品(批号100081-200406,质量分数≥97.3%)(中国药品生物制品鉴定所)；绿原酸对照品(批号20150905，质量分数≥98%)、山奈酚对照品(批号20151122，质量分数≥98%)(上海金瑞生物科技有限公司)；杜仲叶购于陕西普田源杜仲药材种植基地；壳聚糖(郑州天和生物科技有限公司)；甲醇、磷酸(色谱纯)；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

C18色谱柱(200 mm×4.6 mm，10 μm)；以甲醇-0.1%磷酸溶液为流动相，梯度洗脱(甲醇：0～2 min，22%；2～6 min，22～60%；6～20 min，60%；20～24 min，60～22%；24～28 min，22%)；进样量10 μL；流速0.8 mL/min；柱温30℃；检测波长绿原酸为327 nm，芦丁、槲皮素、山奈酚为360 nm。结果见图1。

图1 对照品(A)与杜仲叶样品HPLC图谱(B:327 nm;C:360 nm)

2.2 对照品溶液的制备

精密称取芦丁对照品3.9 mg、槲皮素对照品15.6 mg、山奈酚对照品15.7 mg、绿原酸对照品16.4 mg，置于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，即得混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

2.3.1 绿原酸和芦丁的测定

杜仲叶样品粉碎过4号筛，精密称取0.5 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，超声(100 W，频率100 kHz)提取2次，每次30 min，合并滤液至50 mL的容量瓶中，加70%甲醇定容至刻度，摇匀，过0.45 μm的微孔滤膜，取续滤液即得。

2.3.2 槲皮素和山奈酚的测定

杜仲叶样品粉碎过4号筛，精密称取0.5 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，超声(100 W，频率100 kHz)提取2次，每次30 min，回收溶剂后得到浸膏，向浸膏中加甲醇200 mL、6 mol/L盐酸溶液50 mL，80℃水浴回流水解4 h，再回收溶剂，用70%甲醇定容至100 mL容量瓶，超声震荡30 min使溶解，0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察

精密量取混合对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL分别置于10 mL的容量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀。在上述色谱条件下，进样10 μL，测定峰面积。以浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，进行线性回归，得到绿原酸、芦丁、槲皮素和山奈酚的回归方程分别为：

Y绿原酸=39.71X-59.92(R2=0.999 4)

Y芦丁=20.95X-51.36(R2=0.999 1)

Y槲皮素=54.67X-11.469(R2=0.999 6)

Y山奈酚=507.28X-43.357(R2=0.999 7)

表明绿原酸浓度在16.4～98.4 μg/mL，芦丁浓度在3.9～23.4 μg/mL，槲皮素浓度在15.6～93.6 μg/mL，山奈酚浓度在15.7～94.2 μg/mL范围内线性关系良好。

2.4.2 精密度试验

取供试品溶液连续进样6次，每次10 μL，测定并计算绿原酸、芦丁、槲皮素、山奈酚峰面积的RSD，结果表明RSD分别为1.4%、1.6%、1.4%、1.6%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于 0、2、5、10、16、24 h进样10 μL，计算各成分峰面积的RSD，结果显示绿原酸、芦丁、槲皮素、山奈酚峰面积的RSD分别为1.0%、1.9%、1.8%、1.5%。结果表明供试品溶液中上述4种成分在24 h内稳定性良好。

2.4.4 重复性试验

取杜仲叶同一样品5份，按“2.3”项下方法平行制备供试品溶液，进样测定，计算各成分含量的RSD。结果显示绿原酸、芦丁、槲皮素、山奈酚含量的RSD分别为1.1%、0.9%、1.5%、2.2%。表明该方法重复性较好。

2.4.5 加样回收率试验

精密称取6 份已测含量的陕西商州杜仲叶粉末适量，精密加入适量的绿原酸、芦丁、槲皮素、山奈酚，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，计算加样回收率。结果见表1。

表1 加样回收率试验结果(n=6)

2.5 样品测定

用上述分析方法分析陕西6产地的样品，计算各样品4种待测成分的含量，结果见表2。测定结果显示，陕西5个产地的杜仲叶，其商州杜仲叶中各成分的总含量最高，达到2.008%，质量最佳。

表2 样品测定结果(%)

3 讨论

3.1 提取方法的选择

本文试验考察了超声提取法、微波提取法、热水回流提取法对4种成分的提取效果，实验结果显示超声提取法较其他方法而言提取时间大大缩短，产率也较高，而且超声提取法可在室温下进行，设备简单，操作方便。因此本文选用超声提取法进行杜仲叶的提取。

3.2 提取溶剂的选择

本实验通过单因素实验比较了甲醇、乙醇、水等提取溶剂对提取效果的影响，结果表明甲醇对这4种成分的提取效果较好。在单因素考察的基础上，选择超声提取时间、液料比、甲醇浓度3个因素，采用 L9( 34) 正交表，以4种成分的总提取率为考察指标，对杜仲叶的提取工艺进行优化。最终得到杜仲叶的最佳提取工艺为: 50倍量的70%甲醇超声提取30 min，在此优化工艺条件下，对超声提取次数也进行了考察，结果显示提取2次基本可以提取完全。

3.3 样品的前处理

本文在测定杜仲叶中这4种成分的含量时发现，如果不水解直接测定。实验结果表明槲皮素和山奈酚的含量极低，但将杜仲叶的提取液在酸性条件下进行水解后再测定。结果发现，槲皮素和山奈酚的含量提高有20倍之多，这个实验证明杜仲叶中游离的槲皮素和山奈酚的含量极低。但水解时由于芦丁为苷类化合物，绿原酸分子结构中有一酯键官能团，在酸性条件下，这两种成分都能发生水解反应而使它们的含量测定结果偏低，所以本文采用两步法分别测定了绿原酸、芦丁和槲皮素、山奈酚的含量。

[1] 周云雷,郭婕,王志宏,等. HPLC 法同时测定矮林杜仲叶中6种成分含量[J].中药材,2015,38(3):540-543.

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京：中国医药科技出版社,2015.

[3] 张欣,张春凤.HPLC同时测定杜仲叶中7种成分的含量[J].中国药科大学学报，2012,43(5):435-437.

[4] 王志宏，周云雷，彭胜,等.HPLC法同时测定水解前后杜仲叶黄酮苷元的含量[J].应用化工,2014,43(5):950-956.

Simultaneous Determination of Four Compounds in Leaves of Oliv. by HPLC

WANG Xue-jun,LIANG Xu-hua,XU Heng

(CollegeofBiomedicalandFoodEngineering,ShangluoUniversity,Shangluo726000,China)

Objective: To establish an HPLC method for simultaneous determination of the contents of 4 compounds in the leaves of Oliv..Methods: C18column(200 mm×4.6 mm,10 μm)was adopted.The mobile phase was methanol-1% phosphoric acid solution with gradient elution(methanol：0-2 min，22%；2-6 min，22-60%；6-20 min，60%；20-24 min，60-22%；24-28 min，22%)at a flow rate of 0.8 mL/min and the temperature of column was kept at 30℃.Results: Chlorogenic acid,rutin,quercetin and kaempferol had a good linear relationship in the range of 16.4～98.4,15.6～93.6,15.18-91.07 and 15.7-94.2 μg/mL,and the average recoveries of 4 compounds were 101.0%,98.6%,102.9% and 103.3%,respectively.Conclusion:This method conforms to the validation requirement of methodology,and it can be used for the content determination of chlorogenic acid,rutin,quercetin and kaempferol in the Eucommia ulmoides leaves.

Leaves of Eucommia ulmoides；Chlorogenic acid；Rutin；Quercetin；Kaempferol；HPLC

陕西省自然科学基金项目(No.2014JM4097)；陕西省教育厅项目(No.2013JK0836)；商洛市科学技术研究发展计划专项(No.SK2014-01-12)；商洛学院人才引进项目(No.12sky0016)；陕南秦巴山区生物资源综合开发利用协同创新中心科研基金(No.QBXT-Z(P)-15-19)

王学军(1975-)，男，副教授，博士，主要从事中药有效成分分离分析、结构修饰及新药开发研究工作。

2016-05-12

R

A

1002-2406(2017)01-0033-03

修回日期：2016-06-01