乌腺金丝桃与黄芪配伍对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

付殷，高彦宇，曹明明，王艳丽，李冀

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)



乌腺金丝桃与黄芪配伍对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

付殷，高彦宇，曹明明，王艳丽，李冀*

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

目的：探讨乌腺金丝桃与黄芪配伍对心肌缺血再灌注损伤的保护作用。方法： 采用冠状动脉左前降支结扎法，建立心肌缺血再灌注损伤模型，测定大鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量;采用TUNEL法检测心肌缺血再灌注心肌细胞的凋亡;免疫组化法测定心肌缺血再灌注心肌细胞Caspase-3和TNF-α蛋白表达。结果：与M组比较，P组和H+AM1:2组能够明显提高SOD活性，降低MDA含量;与M组比较，H+AM1:2组明显降低大鼠心肌细胞凋亡指数，P组明显降低大鼠心肌细胞凋亡指数;sham组与M组比较，M组心肌细胞中Caspase-3和TNF-α的蛋白量明显增加，与M组比较，H+AM1:2组和P组能够明显降低Caspase-3和TNF-α的蛋白量。结论：乌腺金丝桃与黄芪配伍对缺血再灌注损伤有一定的保护作用。

乌腺金丝桃；黄芪；心肌缺血再灌注；抗氧化应激；Caspase-3；TNF-α

冠状动脉管腔狭窄或阻塞，导致血流灌注量不足引起心肌功能受损、代谢异常以及结构的改变，进而产生心肌缺血性损伤。损伤发生后及时尽早的恢复血液灌注供应，可以减少心肌梗死面积、改善心肌功能代谢和可逆的结构改变，然而心肌缺血后冠状动脉血流恢复可进一步造成心肌损伤，导致本已存活的心肌细胞死亡[1]。Jennings等首次证明心肌再灌注损伤是一种不同于心肌缺血的病理学现象，并且这种损伤存在于人类当中[2-3]。心肌缺血再灌注损伤成为影响心脑血管疾病治疗的首要考虑因素，因此，深入研究心肌缺血再灌注损伤的发病机制和寻找心肌缺血再灌注损伤的保护药物成为医学和药学工作者的重要研究方向[4-5]。

乌腺金丝桃是藤黄科金丝桃属植物，常用于治疗心悸，胸闷,胸痛[6-7]。现代药理研究表明,乌腺金丝桃能够改善缺血心肌损伤的心肌生理功能和降低脂质过氧化,对心肌缺血再灌注损伤具有保护作用[8-9]。我们前期实验研究表明乌腺金丝桃对缺血性心脏病、心律失常疗效显著。因此本研究旨在探讨乌腺金丝桃与黄芪配伍对心肌缺血再灌注损伤的保护作用和两者的最佳配比。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级Wistar大鼠，体质量220～250 g，雌雄各半，由黑龙江中医药大学动物实验中心提供，动物许可证号：SYXK黑2011001。

1.2 仪器

石蜡切片机和全自动组织包埋机(德国莱卡公司)；BX51生物显微镜(日本奥林巴斯)；双激发荧光光电倍增系统(美国IonOptix公司)；TUNEL试剂盒(Roche公司)。

1.3 分组和给药

将Wistar大鼠随机分为8组，分别为乌腺金丝桃组(H)，黄芪组(AM)，乌腺金丝桃比黄芪1:1组(H:AM1:1)，乌腺金丝桃比黄芪1:2组(H:AM1:2)，乌腺金丝桃比黄芪2:1组(H:AM2:1)，预处理组(P)，模型组(M)，假手术组(Sham)，每组10只大鼠。给药情况为H组(7.875 g/kg)、AM组(10 g/kg)、H+AM1:1组、H+AM1:2组、H+AM2:1组、Sham组、M组和P组连续灌胃14天，其中Sham组、M组和P组给予同体积的生理盐水，Sham组只开胸，不做缺血再灌注手术，P组在心肌缺血再灌注模型建立前首先进行5 min缺血，5 min恢复灌注，重复4次。

1.4 心肌缺血再灌注损伤模型建立

资料[10-11]，Wistar大鼠经25%乌拉坦麻醉，仰卧位固定，气管插管，接实验动物呼吸机，以通气量7～8 ml/kg，通气频率65～70次/min，吸呼比1:2，压力4～5 kPa进行机械通气 。左侧开胸，找到冠状动脉左前降支，手术线结扎，闭合胸腔，观察心电图T波高耸或倒置表明模型建立成功。结扎30 min后松开结扎线，恢复心脏血流，再灌注60 min观测指标。再灌注结束后立即取出腹主动脉血液和心脏。

1.5 血清中SOD活性和MDA含量测定

心肌缺血再灌注60 min后，腹主动脉采血，3 000 r/min，离心10 min，收集血清，按照试剂盒说明测定SOD活性和MDA含量。

1.6 心肌细胞凋亡检测

大鼠处死后，于心尖附近取灌注区心肌组织，4%多聚甲醛固定, 梯度乙醇脱水, 二甲苯透明, 浸蜡, 石蜡包埋切片, 然后参照TUNEL检测试剂盒说明书进行凋亡细胞染色。镜下观察, 凋亡细胞核为棕黄色或黄色, 阴性细胞核呈蓝色。每例切片随机选取视野内细胞分别计数，计数凋亡细胞与总细胞数, 计算细胞凋亡指数(apoptosisindex,AI,AI=凋亡细胞数/总细胞数×100 %)。

1.7 免疫组化检测Caspase-3、TNF-α蛋白表达

再灌注60 min结束后，取大鼠心肌组织，10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片常规脱蜡，3%过氧化氢孵育10 min，PBS冲洗3次，微波修复，加入一抗，4℃过夜，PBS冲洗3次，加入二抗，37℃孵育30 min，PBS冲洗3次，DAB显色，苏木素染色，中性树胶封片，400×显微镜观察，每组随机分析6个高倍镜视野，采用Image-pro plus6.0病理图像分析系统对积分光密度(IOD)即阳性面积×平均光密度进行分析，IOD代表基因和蛋白相对表达量，表达的均值代表该照片的相对表达量。染色结果细胞核呈蓝色，阳性为黄色或黄棕色。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 乌腺金丝桃和黄芪配伍对MIRI大鼠血清SOD活性和MDA含量影响

如表1所示，Sham组与M组比较，M组大鼠血清SOD活性明显降低(P<0.01)；与M组比较，P组大鼠血清SOD活性显著升高(P<0.01)，H+AM1：2与H+AM1:1组SOD活力升高明显(P<0.05)，AM组、H组和H+AM2:1组中大鼠SOD活性无统计学差异(P>0.05)。Sham组与M组比较，M组大鼠血清中MDA含量明显升高(P<0.01)；与M组比较，P组和H+AM1:2组大鼠血清中MDA含量明显降低(P<0.01)，其他组大鼠血清中MDA含量略有降低但无统计学差异(P>0.05)。

组别SOD(U/ml)MDA(nmol/ml)Sham组13.1±4.33**1.92±0.04**M组75.24±2.533.73±0.15P组124.65±8.77**2.01±0.04**AM组93.82±2.213.17±0.05H组94.99±2.653.21±0.07H+AM1:1组105.71±3.49*2.69±0.06H+AM2:1组86.97±2.662.88±0.08H+AM1:2组118.7±2.11*2.1±0.07**

注：与M组比较，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 TUNEL检测MIRI大鼠心肌细胞凋亡情况

由表2和图1可知，与Sham组比较，M组的大鼠心肌细胞凋亡指数明显增高(P<0.01)，与M组比较，P组大鼠心肌细胞凋亡指数明显降低(P<0.01)，H+AM1:2组的大鼠心肌细胞凋亡指数明显降低(P<0.05)，其他组心肌细胞凋亡指数略有降低但无统计学(P>0.05)。

组别ApoptoticIndex(%)Sham组11.12±0.62**M组46.78±0.53P组15.02±0.46**AM组31.09±0.61H组32.99±1.09H+AM1:1组25.27±0.78H+AM2:1组29.70±0.71H+AM1:2组17.43±0.20*

注：与M组比较，*P<0.05，**P<0.01。

图1 乌腺金丝桃和黄芪配伍对MIRI大鼠心肌细胞影响

2.3 乌腺金丝桃与黄芪配伍对MIRI大鼠心肌组织Caspase-3和TNF-α蛋白表达

由表3和图2可知，Sham组与M组比较，M组中Caspase-3和TNF-α的IOD值明显升高(P<0.01)；与M组比较，H+AM1:2组中Caspase-3和TNF-α的 IOD值明显下降(P<0.05)，P组中Caspase-3和TNF-α的IOD值下降最为明显(P<0.01)，其他组与M组比较IOD都有下降的趋势但无统计学差异。

组别Caspase-3TNF-αSham组38345.73±363.08**341.66±317.11**M组71271.69±309.9246733.58±331.72P组42820.09±258.03**36522.92±115.12**AM组59899.89±114.7741907.64±334.42H组49130.18±368.6343723.21±343.14H+AM1:1组47222.65±342.2640211.12±335.63H+AM2:1组58582.38±281.99456.57±234.03H+AM1:2组44843.09±336.82*38367.11±222.76*

注：与M组比较，*P<0.05,**P<0.01。

3 讨论

心肌缺血再灌注时激活内皮细胞或心肌细胞的NADPH氧化酶系统，产生大量的ROS，超过内源性氧自由基清除能力，激发链式脂质过氧化反应，对冠状动脉血管内皮和内腔的细胞造成损伤，从而损伤心肌。MDA是脂质过氧化的代谢产物，反映心肌脂质过氧化的程度指标。SOD是体内氧自由基清除剂，活性高低反应机体清除氧自由基的能力。MDA 与 SOD共同调节心肌组织的抗氧化损伤水平。已有大量文献报道[12-13]，心肌缺血再灌注损伤时，MIRI大鼠模型血清中MDA 含量增高、SOD活力降低，说明此时心肌组织的氧化及抗氧化系统障碍。本研究发现H+AM1:2组能够明显提高MIRI模型大鼠血清中SOD活性和降低MDA含量，这可能降低大量氧自由基对心肌细胞的损伤，其作用机制可能与抑制脂质过氧化反应、维持心肌组织氧化及抗氧化系统的平衡有关。这与Chang研究结果相类似[14]。

图2 MIRI大鼠心肌组织Caspase-3和TNF-α蛋白表达影响

Caspase-3是细胞凋亡过程中起到关键性蛋白，高度表达激活细胞凋亡途径，促进凋亡蛋白质产生，加重心肌细胞的损伤，TNF-α是促炎细胞因子，作用于内皮细胞，激活白细胞趋化黏附因子，导致炎症和损伤的进一步发展，同时TNF-α也能激活黄嘌呤氧化酶产生ROS，进一步损伤心肌细胞。本研究发现，H+AM1:2组能明显降低Caspase-3和TNF-α蛋白表达，对心肌细胞的凋亡起到抑制作用，具有保护心肌缺血再灌注损伤的作用，这可能是通过下调Caspase-3与TNF-α表达，阻断通过激活TNF-α由Caspase-3执行的细胞凋亡过程，降低由TNF-α介导所产生的ROS，以减少心肌细胞凋亡。

本研究以MIRI大鼠为模型，研究乌腺金丝桃与黄芪配伍对心肌缺血再灌注损伤的影响，结果发现H+AM1:2能够明显提高SOD活性、降低MDA含量、下调Caspase-3和TNF-α的蛋白表达，对心肌缺血再灌注的损伤具有一定保护作用，进一步揭示中药能够从多个靶点对抗心肌缺血再灌注损伤。

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Protective Effect of Compatibility of Hypericum Attenuatum and Astragalus Mongholicus on Myocardial Ischemia Reperfusion Injury

FU Yin, GAO Yan-yu, CAO Ming-ming, WANG Yan-li, LI Ji*

(HeilongjiangUniversityofChineseMedicine，Harbin150040，China)

Objective：To investigate the protective effect of compatibility of Hypericum attenuatum and Astragalus mongholicus on myocardial ischemia reperfusion injury (MIRI). Methods：Myocardial ischemia reperfusion injury models were established by ligation of the left anterior descending artery of the coronary artery. Speroxide dismutase (SOD) activity and malondialdehyde (MDA) content were determined in rats’ serum. TUNEL method was used to detect the apoptosis of myocardial cells. Caspase-3 and TNF-α proteins were determined by immunohistochemistry in myocardial cells of myocardial ischemia and reperfusion. Results：Compared with the model group, the pretreatment group and the H+AM1:2group could significantly increase SOD activity and reduce MDA content,and H+AM1:2group could significantly reduce the myocardial apoptosis index in rats. The apoptosis index of myocardial cells was significantly reduced in the pretreatment group. Compared with sham operation group and model group, the protein amount of Caspase-3 and TNF-α in model group was significantly increased. Compared with the model group, H+AM1:2group and pretreatment group could significantly reduce Caspase-3 and TNF-α protein amount. Conclusion：It has a protective effect of compatibility of Hypericum attenuatum and Astragalus mongholicus on myocardial ischemia reperfusion injury.

Hypericum attenuatum; Astragalus mongholicus; Myocardial ischemia reperfusion; Anti-oxidative stress; Caspase-3; TNF-α

国家自然科学基金项目 (No.813733536)

付殷(1985-)，女,博士，黑龙中医药大学中药学博士后科研流动站在站工作人员。

李冀*(1960-)，男，教授，博士研究生导师，主要研究方向: 方剂配伍规律及药效物质基础研究。

2016-07-31

R285.5

A

1002-2406(2017)01-0006-04

修回日期：2016-08-10