钙离子处理对香椿种子萌发及生理特征的影响

刘小丽，石亚男，李 盼，陶苗苗，王诗语

（1.阜阳师范学院 生物与食品工程学院，安徽 阜阳 236037；2.抗衰老中草药安徽省工程技术研究中心 安徽 阜阳 236037）

钙离子处理对香椿种子萌发及生理特征的影响

刘小丽1，2*，石亚男1，李 盼1，陶苗苗1，王诗语1

（1.阜阳师范学院 生物与食品工程学院，安徽 阜阳 236037；2.抗衰老中草药安徽省工程技术研究中心 安徽 阜阳 236037）

本实验以香椿（Toona sinensis）种子为材料，研究不同浓度的钙离子对其种子萌发及生理特性的影响。研究的主要因素包括：种子的发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数等，以及在同样的处理条件下，种子的过氧化物酶的活性、丙二醛的产生量、脯氨酸的积累量和种子浸出液的电导率等生理生化变化。结果表明：香椿对钙离子具有最佳适应浓度，在浓度为550 mg/L时生长情况最好，增加或者减少都将抑制香椿种子的发芽，且高浓度相对于低浓度对香椿种子的发芽率、发芽势的影响更大。

香椿；钙离子；过氧化物酶；丙二醛；脯氨酸

香椿（Toona sincnsisRocm.）为楝科楝属的多年生落叶乔木［1］，以嫩茎芽供食用。香椿嫩芽脆嫩多汁，具有浓郁的独特香气，蛋白质和维生素C含量丰富，极具营养价值，而且树皮、根皮、种子均为上品药材［2］，经济价值极高。我国是唯一用香椿作为蔬菜的国家［3］，利用香椿种子可生产芽苗菜，生产效率更高，且不受季节限制，可全年生产，颇受生产者和消费者欢迎［4］。

近年来香椿的研究主要集中在栽培技术，产品的开发，生长发育，药理及病理等方面[5]。种子的活力是生产中的重要因素，受到其内部生理条件的影响。过氧化物酶（POD）活性、脯氨酸含量、丙二醛（MDA）含量、浸出液电导率等，均与种子活力相关。本实验用不同浓度的钙离子处理香椿种子，进行发芽实验，检测处理后的种子活力变化，同时检测种子内部生理指标的变化，研究钙离子影响种子活力的生理机制。研究优化香椿种子活力的条件，为生产中提高香椿种子的发芽率以及培养壮苗奠定理论基础，以提高香椿培植技术，实现香椿苗大规模生产。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 香椿种子

由安徽省阜阳师范学院抗衰老中草药安徽省工程技术研究中心提供，种子在4℃冰箱保存。实验前将种子放在布袋中轻轻揉搓，然后吹去各种杂质，挑选颗粒饱满、无机械损伤的香椿种子放于铝箔纸中低温保存待用。

1.1.2 试剂

无水氯化钙，蒸馏水，0.1%氯化汞溶液，20mmol/L磷酸二氢钾，反应混合液，冰醋酸，甲苯，3%磺基水杨酸，0.3 mol/L甘露醇，标准脯氨酸溶液，三氯乙酸（TCA），酸性茚三酮试剂，硫代巴比妥酸(TBA)，石英砂。

1.1.3 主要仪器设备

人工常温气候培养箱（LHP-250HE型），电热恒温鼓风干燥箱，加湿器，温湿度器，恒温水浴锅，电子精密天平，冰箱，紫外分光光度计，秒表，磁力搅拌器（78HW-1型），离心机，电导率仪，药品冷藏柜，铝箔纸袋，研钵，培养皿，容量瓶，移液器，锥形瓶以及各种其他常规实验用具。

1.2 方法

1.2.1 种子处理

将香椿种子放入9个小烧杯中，加入氯化钙溶液，浓度梯度为0 mg/L、150 mg/L、300 mg/L、450 mg/L、550 mg/L、650 mg/L、750 mg/L、900 mg/ L、1 050 mg/L。浸泡12 h之后倒掉溶液，去除种皮上的粘液，再次浸泡12 h。每个浓度设置3组重复。

1.2.2 过氧化物酶（POD）活性测定

测定香椿种子的过氧化物酶活性采用愈创木酚法［6］，以1mL KH2PO4与3mL反应混合液作为空白。POD酶活性大小用△OD470/min·g表示。

1.2.3 丙二醛（MDA）产生量的测定

1.2.3.1 MDA的提取

分别称取各个浓度钙离子处理的香椿种子0.2 g加入2mL 10%TCA在研钵中研磨成浆，再加入8mL TCA研磨充分，4 000 r/min离心10 min，取上清液。

1.2.3.2 显色反应与测定

吸取2mL提取液，加入2mL 0.6%TBA，混匀，加盖，沸水浴15 min,迅速冷却离心。取上清液，在532 nm和450 nm处测定OD值。

1.2.4 脯氨酸积累量的测定

取各个钙离子浓度溶液处理的香椿种子0.2 g，用3%磺基水杨酸5mL研磨成浆，分别放入10mL离心管中标记。沸水浴10 min，冷却后，3 000 r/min离心提取上清液待用。

用100 ug/mL脯氨酸配制成0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 ug/mL的标准溶液。各取2mL，加2mL 3%磺基水杨酸、2mL冰醋酸与4mL 2.5%酸性茚三酮在加塞的试管中，沸水浴1小时，冷却加入4mL甲苯，于旋涡混合仪上震荡30 s，静置等待分层。依次吸取上层红色甲苯在520 nm处酶标仪中测定OD值，并绘制成标准曲线。

取待用上清液2mL，分别加入2mL 3%磺基水杨酸，2mL冰醋酸和4mL 2.5%酸性茚三酮试剂。沸水浴1小时，加4mL甲苯，于漩涡混合仪上震荡30 s，静置分层完全后，取上清液测OD值。

1.2.5 电导率的测定

分别取不同浓度溶液处理的香椿种子各50粒，放入盛有50mL去离子水的小烧杯中，于25℃浸泡10 h后，过滤到干净烧杯中，测定滤出溶液电导率。

1.3 实验数据处理

采用Excel进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 钙离子处理对香椿种子发芽的影响

用胚根长度达到种子直径的二分之一为香椿种子发芽的标准，在培养皿中的时间为初始时间，连续三天内无发芽数增长为种子发芽完全。第五天计算发芽势，第十天开始计算发芽率和相对种子鲜重，记录发芽指数(GI),活力指数(VI)。

发芽率=第10天内正常发芽的种子数除以供试种子数×100%；

发芽势=第5天内正常发芽种子数除以供试种子数×100%；

GI=∑Gt/Dt（Gt：与Dt相对应的每天发芽数，Dt：发芽日数）；

VI=GI×S（S：第十天发芽的香椿的相对平均鲜重（mg）[7]）。

由表1可知，不同浓度的钙离子对香椿种子的发芽率和发芽势影响是不相同的。以550 mg/L为峰值呈先升高后下降的趋势。1 050 mg/L接近对照组数值，表明此浓度下对香椿种子的影响是微弱的或无影响。

表1 钙离子处理对香椿种子发芽的影响

2.2 钙离子处理对香椿种子发芽指数的影响

由图1可以得出：香椿种子的发芽指数随着钙离子浓度的不同而不同。在浓度为150到550 mg/L时，发芽指数呈现上升趋势，且每组浓度的发芽指数均高于对照组；在浓度为550 mg/L时，达到最大值。超过最大值后，发芽指数呈现大幅度下降的趋势，促进作用逐步下降。当浓度为1 050 mg/L时，发芽指数接近于对照组26.54，对种子的发芽指数无促进作用。

图1 钙离子处理对香椿种子发芽指数的影响

2.3 钙离子处理对香椿种子活力指数的影响

由表2可以得出：浓度为150到900 mg/L的钙离子溶液对种子的鲜重均有促进作用，且此浓度范围内的种子活力指数都高于对照组38.5。由此得出在150到900 mg/L的浓度对提高种子活力，都有促进的作用。在浓度为150到550 mg/L之间，随着浓度的增加，种子鲜重在增加，种子活力不断提升，在浓度为550 mg/L时，种子鲜重和种子活力均达到最大值。超过这一范围，种子鲜重和活力不断下降。在浓度为1 050 mg/L时，种子鲜重和活力接近于对照组，几乎无促进作用。

表2 钙离子处理对香椿种子活力指数的影响

2.4 钙离子处理对香椿种子过氧化物酶（POD）活性的影响

过氧化物酶广泛存在和分布于植物的各个组织及器官中，能够催化很多生理生化反应。在有过氧化氢的存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成呈茶褐色的物质，该物质在470 nm处有最大光吸收，因此可以利用分光光度计测量470 nm的吸光度的变化，从而测定出POD活性[8-9]。

由图2可知从浓度为0 mg/L到550 mg/L香椿种子的过氧化物酶活性变化不大，但整体呈下降趋势。550 mg/L浓度后到750 mg/L呈增加趋势，且略明显。750 mg/L后增加趋势较大。与发芽势及发芽率大致保持一致。

图2 钙离子处理对香椿种子POD活性的影响

2.5 钙离子处理对香椿种子内丙二醛的积累量的影响

植物细胞在逆境条件下会发生原生质膜过氧化作用，丙二醛是产物之一，通常将其作为脂质过氧化的指标[10]。

由图3可知，随着钙离子浓度的变化，以550 mg/L为最低值，呈先下降后上升的趋势，与发芽率发芽势基本一致。表明在从低钙离子浓度到高钙离子浓度时，植物生长生理所受的外界影响是先胁迫到适宜再到胁迫的过程。丙二醛积累量在750 mg/L后增加明显，表明高浓度钙离子对香椿发芽生理影响较低浓度时大。

图3 钙离子处理对香椿种子内丙二醛的积累量的影响

2.6 钙离子处理对香椿种子内脯氨酸的积累量的影响

在适宜的环境条件下,植物体内游离脯氨酸含量较低。遇到逆境条件时,尤其是干旱、水淹、盐渍等环境下,植物体内游离脯氨酸含量将明显增加。脯氨酸亲水性极强,对于调节细胞渗透平衡、保护细胞结构、防止渗透胁迫对植物造成伤害等方面具有极其重要的作用。

由图4可知，实验测定脯氨酸积累量与香椿的发芽率发芽势一致。保持先下降至550 mg/L后上升的趋势。

图4 钙离子处理对香椿种子内脯氨酸的积累量的影响

2.7 钙离子处理对香椿种子电导率的影响

由图5可知，0到550 mg/L电导率呈下降趋势，550 mg/L到1 050 mg/L呈上升趋势。原因可能有两个方面：一方面适宜的钙离子浓度能够维持细胞膜的稳定性，胞膜完整仍具有选择透过性，因此电导率较低。适宜的钙离子浓度提高了物质运输的效率，使香椿种子代谢速率增强：从而提高了发芽率和发芽势。另外一方面，胞膜的选择透过性并不是无限的，当离子浓度过高，胞膜完整性破坏，选择透过性消失，细胞破裂，溶质渗出，电导率升高。因此电导率可作为衡量细胞完整性高低的指标。

3 讨论

3.1 不同浓度的钙离子对香椿萌发的影响

实验结果表明，香椿对钙离子有最佳适应浓度，在浓度为550 mg/L时生长情况最好。浓度增加或者减少都将抑制香椿种子的发芽。本次实验并未出现处理的种子不发芽现象，0到550 mg/L时钙离子对香椿的萌发有影响，但相对于550 mg/ L到1 050 mg/L时的影响较小。表明香椿种子对钙离子有一定的耐受性，高浓度对香椿种子发芽影响较大。实际种植香椿过程中，应使钙离子浓度保持在最适浓度或之下。

图5 钙离子处理对香椿种子电导率的影响

3.2 不同浓度钙离子对香椿种子生理特性的影响

在尽量排除实验过程的人为和实验仪器的误差条件下，测得的各项生理特性数据和香椿的萌发实验结果具有一致性。表明，钙离子影响种子的生理生化特性，进而影响种子的活力，表现在萌发情况的变化。在550 mg/L浓度下，各项生理指标都是最佳，种子活力最好。因此，想要提升香椿的发芽率提高效益，应尽可能控制钙离子为最适浓度或以下。

钙离子对生长发育有着重要的作用，钙离子不足，会影响细胞的正常生理活动，过多，细胞会通过一定的机制把钙离子排除。适宜的浓度对维持细胞膜的稳定，信息的传递，稳固作物品质都起着重要的作用。

[1]王承南，李 平，谷战英，等.香椿温室水培催芽技术[J].经济林研究，2012，30（4）：159-161．

[2]仲斐友，王 斌.香椿矮化密植栽培技术[J].吉林蔬菜，2016（3）：16-16．

[3]应芳卿，刘宗立.香椿的营养价值及医疗保健作用[J].安徽农学通报，2007，13（9）：84,156．

[4]王元军.植物激素在香椿芽菜生产中作用规律及应用[J].长江蔬菜，2009，11（5）：39-42．

[5]胡选萍.不同营养喷洒液对香椿芽苗生长的效应研究[J].北方园艺，2013（7）：20-22．

[6]李忠光，龚 明.愈创木酚法测定植物过氧化物酶活性的改进[J].植物生理学通讯，2008，44（2）：323-324.

[7]李 立，周 妍，刘 鹏，等.铝对香椿种子萌发的影响[J]．种子，2008，27（1）：30-33．

[8]陈建勋，王晓峰.植物生理学实验指导[M].4版.广州：华南理工大学出版社，2002：227-229．

[9]李泽琴，李静晓，张根发.植物抗坏血酸过氧化物酶的表达调控以及对非生物胁迫的耐受作用[J].遗传，2013，35（1）：45-54．

[10]赵风斌，王丽卿，季高华，等.盐胁迫对3种沉水植物生物学指标及叶片中丙二醛含量的影响[J].环境污染与防治，2012（10）：40-44．

Effects of calcium ion treatment on seed germination and physiological characteristics of Toona sinensis

LIU Xiao-li1，2*，SHI Ya-nan1，LI Pan1，TAO Miao-miao1，WANG Shi-yu1
(1.School of Biology and Food Engineering,Fuyang Normal University,Fuyang Anhui236037,China;2.Engineering Technology Research Center of Anti-aging Chinese Herbal Medicine of Anhui Province,Fuyang Anhui236037,China)

To study the effects of different concentrations of calcium ions on seed germination and physiological characteristics,the Chinese toon(Toona sinensis)seed was used as material in the experiment.The main factors included：seed germination rate,germination potential,germination index,vigor index,and under the same treatment conditions,biochemical changes of peroxidase activity,malondialdehyde production,proline accumulation and conductivity of seed leaching solution.The results showed that Toona sinensis had the best ability to adapt a concentration of calcium ion.It grew best at the concentration of 550 mg/L.Increasing or decreasing the concentration inhibited the Toona sinensis seed germination.A high concentration affected the Toona sinensis seed germination rate and germination potential greater than the low concentration did.

Toona sinensis;calcium ion;peroxidase;malondialdehyde;proline

Q-945.4

：A

：1004-4329（2016）04-053-05

10.14096/j.cnki.cn34-1069/n/1004-4329(2016)04-053-05

2016-08-20

安徽省教育厅自然科学研究重点项目（KJ2016A872，KJ2016A871）；大学生创新训练项目（201510371059）资助。

刘小丽（1967- ），女，博士，副教授，研究方向：生药学。Email：liu_x_l2002@sina.com