金针菇工厂化栽培过程中游离氨基酸变化情况的初步研究

王红梅，程向阳，张光忠，余养朝，王瑞娟，鲍大鹏，茅文俊*

（1上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所，上海 201403；2上海市农业科学院食用菌研究所，农业部南方食用菌资源利用重点实验室，国家食用菌工程技术研究中心，国家食用菌加工技术研发分中心，上海市农业遗传育种重点开放实验室，上海 201403；3江苏华绿生物科技股份有限公司，江苏 223700）

金针菇工厂化栽培过程中游离氨基酸变化情况的初步研究

王红梅1，程向阳2，张光忠3，余养朝3，王瑞娟2，鲍大鹏2，茅文俊2*

（1上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所，上海 201403；2上海市农业科学院食用菌研究所，农业部南方食用菌资源利用重点实验室，国家食用菌工程技术研究中心，国家食用菌加工技术研发分中心，上海市农业遗传育种重点开放实验室，上海 201403；3江苏华绿生物科技股份有限公司，江苏 223700）

为了探索金针菇栽培过程中氮素营养成分的变化规律，对金针菇整个栽培周期基质-菌丝体混合物中游离氨基酸含量和子实体中游离氨基酸含量的动态变化进行了研究。结果表明：基质-菌丝体混合物中总游离氨基酸含量在发菌期显著上升，至出原基期达到最高为初始状态的12.95倍，搔菌前含量最丰富的氨基酸为精氨酸，达到最高值2 279.57 μg/g（占比15.57%），搔菌后，精氨酸快速积累趋势改变，而谷氨酸、丙氨酸、天冬酰胺等氨基酸继续积累，至原基形成时，含量最高的氨基酸分别是精氨酸2 213.39 μg/g（占比10.41%）和谷氨酸2 147.53 μg/g（占比10.10%），出原基到子实体成熟过程中基质菌丝体中几乎所有游离氨基酸含量都逐渐减少。在子实体中谷氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸是含量最高的氨基酸。由此推测在金针菇子实体形成过程中，菌丝可以转运与利用精氨酸、谷氨酸、丙氨酸等多种氨基酸，多种游离氨基酸的运输为金针菇子实体的快速发育提供了物质保障。

金针菇；菌丝体；子实体；氮素营养；氨基酸；工厂化栽培

金针菇（Flammulina velutipes）又名朴菇、冬菇、毛柄金钱菌、构菌、青杠菌等［1］，营养丰富，口感鲜美，受到广大消费者喜爱，又因其富含赖氨酸和精氨酸，因此被称之为增智菇。金针菇在我国是一种普遍栽培食用菌，也是我国工厂化生产的主要食用菌之一［2］。为了提高金针菇的产量，同时降低生产成本，金针菇栽培基质配方的研究受到了广泛重视。氮源是食用菌生长发育的重要营养源，是合成氨基酸、蛋白质和核酸的原料［3］。目前对于金针菇栽培基质的配方研究主要集中于碳氮源的种类与比例方面［4］，鲜有报道与碳素、氮素营养的吸收、传递等相关的分子基础的研究。

在丛枝菌根真菌中，基质菌丝吸收的氮素大部分储存于精氨酸中［5］，通过精氨酸酶水解为尿素和鸟氨酸，鸟氨酸由鸟氨酸氨基转移酶和鸟氨酸脱羧酶转化为谷氨酸［6-8］。在金针菇中，氮素营养的储存、传递、转运是否与丛枝菌根真菌类似，还是有其自身特点，都需要通过对金针菇的氮源代谢进行研究后才能给出解答。

试验研究金针菇整个栽培周期中基质菌丝体、子实体中氨基酸含量的动态变化情况，旨在探索金针菇栽培过程中菌丝吸收利用氮后合成的有机氮载体种类以及转运和传递方式，为深入研究金针菇栽培过程中氮素营养代谢规律奠定基础，为优化金针菇培养料提供理论支持。

1 材料与方法

1．1 供试材料

1.1.1 供试菌株

金针菇134菌种由上海市农业科学院食用菌研究所保藏和提供。

1.1.2 子实体栽培及样品收集

本试验中子实体栽培方式为瓶栽。培养料配方：棉籽壳77%，石膏粉1%，白糖1%，石灰3%，玉米粉18%，菜籽饼5%，含水量65%。栽培过程简述如下：接种后，将菌种瓶移入培养室发菌培养，温度20—22℃，相对湿度60%—70%，二氧化碳浓度0.3%。搔菌处理是在菌丝体布满培养料的90%—100%时进行。搔菌后进行催菇，温度14—15℃，湿度95%—99%，二氧化碳浓度0.1%—0.2%。当菇蕾出现2—3 d后，把菌瓶移到抑制室，采用光线抑制，抑制期需要5—7 d，抑制后期进入伸长期，当菇蕾伸出瓶口2 cm左右，套纸筒。控制在6—8℃，湿度在80%—85%。

在金针菇样品采集点分别是原始培养料（第0天）、搔菌当天（第30天）、搔菌处理第6天（第36天）、原基（第38天）、小子实体（第41天）、中子实体（第50天）与大子实体（第54天）。其中出原基前只采集培养料基质，出原基后分别对培养料基质和子实体共同采集。

对培养瓶中含有菌丝的基质的采集，挖取距离瓶口7—10 cm处的全部培养料，置于65℃烘箱经10 h烘干至样品恒重，用DJ-10A型粉碎机（上海淀久中药机械制造有限公司）粉碎，粉碎样品过20目的筛子，备用。对子实体和原基样品采集子实体的菌柄中部部分。采集到的样品经液氮快速冻结后，置于真空冷冻干燥机内，抽真空1—3 d，直至水分完全升华。

1．2 仪器与设备

L-8900氨基酸自动分析仪。

1．3 方法

1.3.1 游离氨基酸含量测定

参照王逍君等［9］与高燕红等［10］的方法，略作修改，简述如下：准确称取待测样品1 g于Eppendorf管中，加入30 mL 0.1 N的盐酸，40℃超声提取30 min，室温静置30 min后于5 000 r/min离心机离心5 min，取上清800 μL，以1∶1比例加入10%磺基水杨酸，混合液4℃放置30 min，12 000 r/min 4℃离心30 min，取上清，加入10 mol/L氢氧化钠调节pH至2左右，12 000 r/min 4℃离心10 min，取上清过0.22 μm MCE微孔滤膜，通过L-8900氨基酸自动分析仪进行游离氨基酸含量测定。

1.3.2 数据分析

所有数据均是通过3次重复试验所得。所得数据采用Excel 2003和SPSS 13.0软件进行统计学分析。

2 结果与分析

2．1 金针菇整个栽培周期基质菌丝体中氨基酸含量的动态变化

工厂化生长金针菇的生长周期约为55 d。本研究中金针菇原始栽培料中总游离氨基酸初始状态含量为1 641.85 μg/g，含量极低。在为期30 d的发菌期内，菌丝活动使培养料基质分解产生大量的游离氨基酸，含量达到14 633.27 μg/g，是初始状态的8.92倍。游离氨基酸含量在出原基点达到最高值，为21 260.31 μg/g，是初始状态的12.95倍。其后随着金针菇子实体的发育，总量逐渐减少，到大子实体时为5 222.86 μg/g，是初始状态的3.18倍。发菌和搔菌处理阶段，金针菇培养料中含量丰富的氨基酸是精氨酸，含量占游离氨基酸总量的8.90%—15.57%。谷氨酰胺含量在搔菌处理后达到最高水平为917.01 μg/g。随生长延续其含量逐渐降低，到大子实体时含量为242.55 μg/g，是搔菌处理后最高水平的26.5%。其余游离氨基酸如谷氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、亮氨酸、脯氨酸等游离氨基酸含量在出原基前逐渐升高。所有的游离氨基酸在出原基之后均表现为一致的变化趋势，即随着子实体的发育，培养料中的各游离氨基酸含量逐渐下降（表1）。

表1 金针菇整个栽培周期中基质-菌丝体混合体中氨基酸含量Table 1 Amino acid contents of substrate-mycelium mixture in whole F．velutipes cultivation cycleμg·g－1

2．2 金针菇整个栽培周期子实体中游离氨基酸含量的动态变化

金针菇子实体中游离氨基酸含量（以大子实体期计）较高的主要有：谷氨酸7 648.34 μg/g、谷氨酰胺3 909.90 μg/g、丙氨酸5 178.80 μg/g、苯丙氨酸3 276.18 μg/g等。从表2可以看出，原基期谷氨酸含量（8 407.35 μg/g）和中子实体期丙氨酸含量（5 649.67 μg/g）较其他几种氨基酸高。谷氨酸在子实体发育进程中，变化不显著；丙氨酸在由中子实体向大子实体生长过程中含量有所降低；谷氨酰胺在子实体发育初期有所上升，到中子实体向大子实体转变时，变化不显著，精氨酸在子实体游离氨基酸中含量较低，且维持在较低的含量，变化不显著；鸟氨酸含量在出原基后缓慢上升，子实体发育后期显著升高。

表2 金针菇整个栽培周期子实体中氨基酸含量Table 2 Amino acid contents of fruiting bodies in whole F．velutipes cultivation cycleμg·g－1

3 讨论

相较于总氨基酸，游离氨基酸的含量变化对反映生物体不同生长发育时期氮代谢的变化，对氮素的吸收、运输、同化及营养状况等更具重要意义。食用菌菌丝接种之后，进入发菌阶段，该过程是通过菌丝“吃料”，使菌丝充盈整个培养基质［11］。之后进入发菌后期，进一步堆积菌丝生物量，基质间隙完整被菌丝体充盈。在本研究中发现金针菇培养料中总的游离氨基酸的量以及大多数氨基酸在接种后都在增加，搔菌后继续增加或维持不变。这说明这一阶段前期菌丝代谢活动旺盛，能够大量的分解培养料中的氮素营养并转化为游离氨基酸，并且其生成游离氨基酸的速率大于其自身利用与运输游离氨基酸的速率，完成营养积聚，为形成子实体做准备。

在发菌过程中，由于菌丝生长造成呼吸热使水分蒸发，上层菌丝老化，甚至形成菌皮菌膜，阻碍空气相对湿度与内部菌丝接触，对新鲜空气接触不畅［12］。搔菌处理一方面使新生菌丝充分接触新鲜空气和空间相对湿度，提高菌丝生命力，另一方面在有效的物理刺激能使菌丝由营养生长向生殖生长转变。在本研究中发现，搔菌处理还会影响金针菇培养料中多种氨基酸的积累趋势，从接种到搔菌处理前精氨酸在金针菇培养料中快速积累，为各氨基酸中积累速度最快，至搔菌处理时已占总氨基酸含量的比例达到15.6%，但是在搔菌处理后培养料中的精氨酸未进一步提高，并保持着相对高的含量，可能是精氨酸的生成与运输形成了一种平衡。与此同时，培养料中谷氨酸、天冬氨酸等其他多种氨基酸在搔菌处理后至原基形成前进一步积累。其中谷氨酸搔菌后至出原基的增速是搔菌前的3.8倍，丙氨酸增速则由搔菌前的－7.27 μg/（g·d）变为搔菌后的205.1 μg/（g·d）。出原基后，金针菇子实体迅速形成，需要大量的氮源物质，各种游离氨基酸同步减少，推测在金针菇中，与已报道的丛枝菌根真菌不同，精氨酸只是菌丝能转运氨基酸的其中一种形式，而不是唯一的，多种氨基酸可能都可以被金针菇菌丝转运与利用，这可能也是金针菇子实体发育比较迅速的原因。

谷氨酸在真菌进行氨基酸生物合成中起到了桥梁作用。无机氮被还原成氨，氨与α-酮戊二酸结合，形成L-谷氨酸，L-谷氨酸积极参与转氨反应并在特殊的合成途径中形成其它氨基酸。此反应是可逆反应，谷氨酸失去的氨基后，其骨架以α-酮戊二酸的形式进入三羧酸循环。本研究中，谷氨酸、丙氨酸的积累速度在原基形成前不断提高，于搔菌后6 d至原基形成期增速达到最高。此后在金针菇子实体发育中，谷氨酸含量和丙氨酸含量也均保持较高水平，谷氨酸的代谢和三羧酸循环相关［13］，丙氨酸则由糖酵解的中间产物生成，这也侧面证实金针菇子实体的发育中氮代谢和碳代谢之间是相互联系、相互交织的。丙氨酸的含量在形成大子实体时明显下降，表明随着金针菇子实体的成熟与担孢子的形成，丙氨酸含量相应减少。鸟氨酸循环在真菌中的作用是提供合成蛋白质所需的精氨酸。在此循环中，精氨酸水解生成尿素并再生鸟氨酸，金针菇鸟氨酸的含量变化可以反映尿素的含量变化，从本实验结果可见鸟氨酸是少数在金针菇的子实体发育后期仍然增高的氨基酸，由此可见金针菇的子实体发育后期尿素含量有所积累。尿素的积累是担子菌处理剩余氮素的一种表现，避免过多的NH4+对细胞的毒害，这部分尿素会转移到菌盖中，尿素吸水平衡渗透压［14］。

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（责任编辑：程智强）

Preliminary study on variation of free amino acids during factory cultivation of Flammulina velutipes

WANG Hong-mei1，CHEN Xiang-yang2，ZHANG Guang-zhong3，YU Yang-chao3，WANG Rui-juan2，BAO Da-peng2，MAO Wen-jun2*
（1Institute for Agro-Food Quality Standards and Testing Technology，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201403，China；2Institute of Edible Fungi，Shanghai Academy of Agricultural Sciences；Key Laboratory of Southern Edible Fungi Resources and Utilization，Ministry of Agriculture；National Engineering Research Center of Edible Fungi；National R＆D Center for Edible Fungi Processing；Shanghai Key Laboratory of Agricultural Genetics and Breeding，Shanghai 201403，China；3Jiangsu Hualü Biological Technology Co.Ltd.，Jiangsu 223700，China）

In order to explore the component variation of nitrogen nutrition during F.velutipes cultivation，the free amino acid contents of both substrate-mycelium mixture and fruiting bodies were investigated in the whole culturing period.The results showed that the total free amino acid content of the mixture significantly increased at the spawn running stage and reached the highest at the primordial stage，being 12.95 times as much as the initial quantity；Before scratching，arginine was the most abundant in the amino acids of the mixture and reached the highest value of 2 279.57 μg/g（15.57%）；while after scratching，the trend of accumulating arginine was changed，some other amino acids such as glutamic acid，alanine and aspartic acid still accumulated，and at the primordium initiation stage the highest contents of amino acids were respectively arginine 2 213.39 μg/g（10.41%）and glutamic acid 2 147.53 μg/g（10.10%）.From the primordium initiation to the fruiting body maturation the contents of almost all amino acids gradually decreased.Glutamic acid，glutamine and alanine werethe most abundant in the amino acids of the fruiting body.From the above results it was concluded that in the formation of F.velutipes fruiting bodies，the mycelia could transport and utilize a variety of amino acids such as arginine，glutamic acid and alanine，and transporting various free amino acids provided a material basis for rapid development of F.velutipes fruiting bodies.

Flammulina velutipes；Mycelium；Fruiting body；Nitrogen nutrition；Amino acids；Factory cultivation

S646.15

A

1000-3924（2016）06-005-05

2016-04-25

上海市科学技术委员会工程技术研究中心能力提升项目（16DZ2281300）

王红梅（1968—），本科，高级实验师，主要从事农产品质量检测。E-mail：wanghm＠hotmail.com

*通信作者，E-mail：mwjtry123＠126.com