蛹虫草凝集素编码基因JRL-ccm4的初步研究

鲍大鹏，马元伟，2，王 荣，刘敏祥，茅文俊，汪 滢*

（1上海市农业科学院食用菌研究所，上海 201403；2上海海洋大学食品学院，上海 201306）

蛹虫草凝集素编码基因JRL-ccm4的初步研究

鲍大鹏1，马元伟1，2，王 荣1，刘敏祥1，茅文俊1，汪 滢1*

（1上海市农业科学院食用菌研究所，上海 201403；2上海海洋大学食品学院，上海 201306）

通过对蛹虫草基因组数据挖掘，发现Jacalin类凝集素编码基因JRL-ccm4，进而对该基因及其编码产物进行了生物信息学分析，通过原核异源表达获得凝集素蛋白JRL-ccm4，并检测了表达产物的生物学活性测定；通过RT-PCR对不同生长时期的蛹虫草样品中JRL-ccm4基因的表达水平进行了检测。研究结果表明：JRL-ccm4蛋白有一个JRL结构域，能在原核细胞中成功表达；异源表达的JRL-ccm4蛋白具有抑制金黄色葡萄球菌的活性，有一定抑制人宫颈癌细胞HeLa增殖的活性；原基期JRL-ccm4基因表达水平最高，是菌丝期的3.49倍，是子实体时期的2.39倍，表明JRL-ccm4基因可能参与蛹虫草子实体形成过程。

蛹虫草；凝集素；生物信息学分析；异源表达；基因功能

蛹虫草（Cordyceps militaris）又名北虫草，属于子囊菌门（Ascomycota）、麦角菌目（Clavicipitales）、麦角菌科（Cordyceps）。现代医药学研究表明，蛹虫草具有抗疲劳、抗缺氧、抗衰老、以及增强人体非特异性免疫系统的作用［1］，并对S180艾氏腹水瘤有明显的抑制效果，同时对化疗药物环磷酰胺具有增效和降低毒性作用［2］。

凝集素是一种非免疫来源的糖结合蛋白，能使细胞凝集或糖缀合物（glycoconjugate）沉淀［3］。凝集素是食药用真菌中重要的活性成分，大型真菌中含有种类丰富的凝集素，对其开展的研究越来越受到关注。Jacalin类凝集素（Jacalin-related lectins，JRLs）在植物中是一类能够与内源糖类化合物结合的非经典型凝集素，研究表明，这类凝集素在植物中能够响应生物或非生生物胁迫刺激，参与细胞调控与信号转导，行使内源功能［4］，与经典凝集素在功能上有着明显区别［5］。在食、药用真菌中，Jacalin类凝集素首先在灰树花（Grifola frondosa）中被发现，深入研究表明其最大凝集活性表现在子实体阶段，在菌丝及原基中凝集活性较低［6］。但是目前对食药菌中Jacalin类凝集素的功能还缺少深入研究。

在前期工作，本研究团队从蛹虫草基因组中通过数据挖掘获得了一个编码Jacalin类凝集素的基因，在此基础上，本研究对该凝集素编码基因进行了原核异源表达，构建了高效异源表达体系，检测了异源表达的凝集素的生物活性，并测定了蛹虫草不同生长时期该凝集素编码基因的表达水平，为进一步深入研究和利用蛹虫草凝集素提供了有力的科学基础。

1 材料与方法

1．1 材料

1.1.1 供试菌株 蛹虫草CM-01由中科院上海植物生理生态研究所王成树实验室提供。

1.1.2 培养基与试剂 PDA培养基：土豆200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水定容至1 000 mL。

PDB培养基：土豆200 g，葡萄糖20 g，蒸馏水定容至1 000 mL。

LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，蒸馏水定容至1 000 mL。

丙烯酰胺、N，N-亚甲叉丙烯酰胺、IPTG、SDS、考马斯亮蓝R-250、过硫酸铵、甘氨酸、Tris试剂均购自国药集团；蛋白酶抑制剂、反转录及RT-PCR试剂盒、内切酶、DNA T4连接酶和高保真DNA聚合酶均购自大连宝生物工程有限公司；质粒提取试剂盒、蛋白定量检测试剂盒、PCR产物回收试剂盒和RNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；表达菌株BL21购自上海生工生物工程有限公司；引物合成和基因测序均由上海生工生物工程有限公司完成。

1．2 试验方法

1.2.1 蛹虫草JRL-ccm4基因的生物信息学分析 根据对蛹虫草基因组测序分析，确定出甘露糖结合凝集素编码基因JRL-ccm4（GenBank：XM-006666406）［7］，采用Protparam软件对该基因编码的凝集素蛋白的基本理化性质进行分析预测；采用SignalP 4.1 Server进行凝集素蛋白信号肽预测与分析；采用InterPro对凝集素蛋白保守结构域进行分析；运用NetNGlyc 1.0 Server分析凝集素蛋白糖基化位点；利用ClustalX的Muscle比对方法进行同源比对，参数为默认值；通过TMHMM Sevrver 2.0软件对凝集素蛋白的跨膜区进行预测和分析，并采用TargetP 1.1 Sever软件对凝集素蛋白进行亚细胞定位预测［8］。

1.2.2 蛹虫草JRL-ccm4基因的扩增与原核表达 用25℃，150 r/min振荡培养4 d的蛹虫草菌丝提取RNA，以总RNA为模板反转录成cDNA，再以cDNA作为模板采用高保真DNA聚合酶扩增出凝集素JRL-ccm4基因，经EcoRI酶切，纯化后用T4连接酶连接到经EcoRI消化的pET32a载体上，测序验证连入方向及表达阅读框正确后，将表达载体pET-JRL-ccm4转化到表达菌株BL21中；挑取阳性克隆，用LB液体培养基培养过夜，菌液以1∶50扩大培养200 mL，37℃培养至OD600nm＝0.4—0.6，加入IPTG至终浓度为0.2 mmol/L，16℃诱导表达12 h。

1.2.3 重组蛹虫草凝集素蛋白JRL-ccm4的提取 8 000 r/min、4℃离心5 min，收集诱导表达的菌体，加1 mL PBS重悬，加入5 μL蛋白酶抑制剂，用液氮速冻后进行研磨，用5 mL PBS冲洗研钵，收集冲洗液置于离心管，12 000 r/min、4℃离心15 min，收集上清和沉淀。SDS-PAGE检测目的蛋白的表达情况，经细菌过滤器除菌后置于－20℃保存。

1.2.4 重组蛹虫草凝集素蛋白JRL-ccm4抑菌活性测定 固体LB培养基融化后，待温度降至50℃时，以1%的接种量加入过夜培养的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌菌液，混匀后立即倒平板，待平板凝固后在表面滴加2 μL蛋白提取液，以空载体表达产物作为阴性对照，用氨苄青霉素作为阳性对照，将平板置于37℃培养10 h后观察结果。

1.2.5 重组蛹虫草凝集素蛋白JRL-ccm4抑制人宫颈癌细胞HeLa增殖试验 收集生长至对数期的HeLa细胞，调整细胞悬液浓度至5×104个/mL，加入96孔板（100 μL/孔）后，置5%CO2下，37℃孵育至细胞单层铺满孔底，加入蛋白提取液，每个样品做3个重复。5%CO2，37℃孵育24 h后，倒置显微镜下观察细胞长势。每孔加入20 μL浓度为5 mg/mL的MTT溶液，继续培养4 h；然后小心吸去孔内培养液，每孔加入150 μL DMSO，置摇床上低速振荡5 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪测量570 nm处各孔的吸光值。

1.2.6 蛹虫草不同生长时期JRL-ccm4基因表达的相对定量 25℃，150 r/min振荡培养4 d的蛹虫草菌丝，过滤收集后置于－80℃保存；滤液中包含了大量芽生孢子，取200 μL滤液注射至单个蚕蛹，置于25℃培养20 d至虫体长出菌丝体后，转至22℃光照培养箱诱导原基形成，然后收集原基置于－80℃保存；继续培养30 d至子实体成熟，收集子实体，同时提取菌丝、原基、子实体的总RNA，采用两步法进行荧光定量PCR。

提取样品总RNA后反转录为cDNA备用，选用微管蛋白基因（Tubulin）作为内参基因，使用DNAMAN软件进行引物设计（表1）。反应体系（20 μL）为：2×SYBR Premix Ex Taq 10.0 μL，10 μmol/L的上下游引物各0.8 μL，cDNA模板2 μL，ROX Reference Dye（50×）0.4 μL，ddH2O 6 μL。PCR反应条件：94℃，5 min；95℃30 s，60℃30 s，40个循环，72℃延伸5 min。

表1 荧光定量PCR使用引物Table 1 Primer for RT-PCR

2 结果与分析

2．1 蛹虫草JRL-ccm4基因的生物信息学分析

蛹虫草JRL-ccm4基因序列为2 292 bp，根据cDNA序列推导出所编码的凝集素蛋白JRL-ccm4的氨基酸序列，共有764个氨基酸残基，分别在186、376、523位氨基酸残基处有糖基化位点，530—550位预测可能有一个跨膜结构，JRL-ccm4蛋白分子量为83.35kDa，理论等电点（pI）为8.76，不稳定系数为46.57，脂肪系数为71.69；无信号肽，亚细胞定位结果显示该凝集素蛋白在线粒体基质中，置信度为76.2%。从第630—764个氨基酸残基位置为保守结构域；将蛹虫草凝集素蛋白JRL-ccm4氨基酸序列用BLAST程序在Non-redundant GenBank数据库中进行蛋白质同源性检索，用ClustalX比对结果发现它与来源于布氏虫草（C.brongniartii）、镰刀菌（Fusarium langsethiae）、绿僵菌（Metarhizium brunneum）的凝集素蛋白相似性分别达到83.42%、55.64%和58.25%。由此可见，蛹虫草JRL-ccm4基因编码的蛋白JRL-ccm4与真菌凝集素蛋白家族具有同源性，可以判定为是一种新的真菌凝集素蛋白。

2．2 蛹虫草JRL-ccm4基因的扩增与原核表达

利用DNAMAN软件设计的引物序列为上游5’-GAATTCATGGCCCCCAGATTTCTC-3’，下游5’-GAATTCGTACGTATTACCCTCCG TCA-3’，将JRL-ccm4基因连入PET-32a载体。经测序验证表达框正确，可以用于蛋白表达。在BL21菌株中经12 h诱导表达后，SDS-PAGE电泳检测目的蛋白表达情况（图1），可以发现经诱导的菌株中产生分子量约为80 kDa的蛋白条带。

2．3 重组蛹虫草凝集素蛋白JRL-ccm4抑菌及抑制人宫颈癌细胞HeLa增殖活性

蛹虫草凝集素蛋白JRL-ccm4提取液对大肠杆菌生长无抑制作用，而对金黄色葡萄球菌有一定抑制效果，Amp作为阳性对照，抑菌圈直径为（2.1±0.1）cm；JRL-ccm4蛋白抑菌圈直径为（1.2±0.1）cm（图2）。用蛋白浓度测定试剂盒测得蛋白提取液浓度为1.8 mg/mL，对人宫颈癌细胞HeLa增殖的抑制率为11.7%。

图1 异源表达JRL-ccm4蛋白的SDS-PAGE分析Fig．1 SDS-PAGE for heterologous expression of JRL-ccm4

图2 JRL-ccm4蛋白抑制金黄色葡萄球菌生长Fig．2 JRL-ccm4 inhibits the growth of Staphylococcus aureus

2．4 蛹虫草不同生长时期JRL-ccm4基因表达的相对定量

不同生长时期的蛹虫草形态见图3。以菌丝期JRL-ccm4基因的表达量为对照组进行数据分析，原基期的表达量上调了3.49倍，子实体期较菌丝期上调了1.46倍，结果表明JRL-ccm4基因在原基期有较高的表达量，可能在原基形成或子实体形成过程中起到调节作用。

图3 不同生长时期的蛹虫草Fig．3 Different growing stage of C．militaris

3 讨论

蛹虫草的人工栽培获得成功和系列产品的开发，丰富了食用菌类的滋补保健品和功能食品［9］。肖磊［10］曾经从蛹虫草子实体中分离纯化出了凝集素并做了生物活性分析，结果表明蛹虫草凝集素对6种病原真菌有较强的抑制作用，皮下注射凝集素对小猫淋巴瘤有明显的抑制作用，但对蛹虫草凝集素在体内的作用以及相关分子生物学研究一直存在空白。

在本研究的前期工作中，通过对蛹虫草的基因组和转录组数据分析，发现数个凝集素编码基因并都具有一定水平的表达。本研究选择其中表达水平较高的JRL-ccm4基因进行了常规的分子生物学研究，所建立的技术路径和所获得的研究结果对进一步在分子层面深入了解蛹虫草凝集素的功能和开发价值提供了工作基础。

本研究结果表明蛹虫草JRL-ccm4基因在原基期的表达量最高，推测该基因可能与子实体发育调控相关联。但是由于基因表达后还需要一个翻译合成蛋白的过程，所以在蛹虫草中Jacalin类凝集素的最高凝集活性也可能会出现在子实体生长阶段，这与Nagata等［6］的研究发现灰树花中Jacalin类凝集素的凝集活性在子实体阶段达到最高的研究结果具有一致性。但是该基因是否是蛹虫草子实体形成所必需的关键基因，以及Jacalin类凝集素在子实体发育中起何种作用，还需要通过基因敲除等研究手段加以深入研究。

［1］KUO Y C，LIN C Y，TSAI W J，et al.Growth inhibitors tumor cells inCordyceps sinensis other than cordycepin and polysaccharides［J］.Cancer Investigation，1994，12（6）：611-615.

［2］陈桂宝，罗梅初，刘实晶，等.蛹虫草的药理作用研究［J］.中草药，1997，28（7）：415-417.

［3］GOLDSTEIN I J，HUGHES R C，MONSIGNY M，et al.What Should Be Called a Lectin［J］.Nature，1980，285（5760）：66-66.

［4］XIANG Y，SONG M，WEI Z Y，et al.A jacalin-related lectin-like gene in wheat is a component of the plant defence system［J］.Exp Bot，2001，62（15）：5471-5483.

［5］VAN BAMMEEJ E J M，BARRE A，ROUGE P，et al.Cytoplasmic nuclear plant lectins：a new story［J］.Trrends Plant Sci，2004，9（10）：484-489.

［6］NAGATA Y，YAMASHITA M，HONDA H，et al.Characterization，occurrence and molecular cloning of a lectin fromGrifola frondosa：jacalinrelated lectin of fungal origin［J］.Biosci Biotecchem，2005，69（12）：2374-2380.

［7］ZHENG P，XIA Y L，XIAO G H，et al.，Genome sequence of the insect pathogenic fungusCordyceps militaris，a valued traditional chinese medicine［J］Genome Biology，2011，12：R116.

［8］何述栋.黑芸豆凝集素的纯化和生物信息学及结构与功能特性研究［D］.哈尔滨：哈尔滨工业大学，2015.

［9］陈艳秋.蛹虫草人工优质高产栽培技术研究［J］.中国食用菌，2002，21（5）：20-22.

［10］肖磊.蛹虫草凝集素的纯化、生化性质测定及其抗肿瘤、抗植物病原真菌的研究［D］.北京：中国农业大学，2004.

（责任编辑：张睿）

Preliminary study of a jacalin-related lectin-like gene JRL-ccm4 in Cordyceps militaris

BAO Da-peng1，MA Yuan-wei1，2，WANG Rong1，LIU Min-xiang1，MAO Wen-jun1，WANG Ying1*
（1Institute of Edible Fungi，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201403，China；
2College of Food Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

Through the Cordyceps militaris genome data mining，a lectin gene encoding JRL-ccm4 was found.In this research，the gene and its encoding product were analyzed by bioinformatics，and heterologously expressed and examined the biological activity of the protein in Escherichia coli.The JRL-ccm4 gene expression level in different growth periods of C.militaris was tested by qRT-PCR.The results showed that the JRL-ccm4 proteins had a JRL domain structure which could be successfully expressed in prokaryotic cells.The protein of the JRL-ccm4 could inhibit growth of Staphylococcus aureus and partly inhibit cervical cancer HeLa cell proliferation；the JRL-ccm4 had the highest amount of gene expression in stromata，which was 3.49 times that of hyphae period and 2.39 times in the period of the fruiting body.It suggested that the gene could be related to fruit body development.

Cordyceps militaris；Lectin；Bioinformatics analysis；Heterologous expression；Gene function

S567.35；S646

A

1000-3924（2016）06-001-04

2016-10-20

上海市青年人才成长计划2015（1-10）

鲍大鹏（1969—），男，博士，研究员，主要从事真菌分子遗传研究。E-mail：baodp＠hotmail.com，Tel：18918162096

*通信作者，E-mail：wyhrx＠126.com