双抗体夹心ELISA法检测上海崇明水仙的5种病毒

卞黎霞

（崇明县林业站，上海 202150）

双抗体夹心ELISA法检测上海崇明水仙的5种病毒

卞黎霞

（崇明县林业站，上海 202150）

以崇明水仙露地栽培中出现的褪绿、斑驳、花叶和黄条等多种症状的植株为样本，以水仙试管脱毒苗为参照，采用DAS-ELISA法定量检测了烟草花叶病毒（TMV）、黄瓜花叶病毒（CMV）、水仙潜隐病毒（NLV）、水仙花叶病毒（NMV）和水仙黄条病毒（NYSV）5种病毒病。结果发现全部样本带毒率共计50.8%，复合感染带毒率11.1%；54份露地栽培的样本中TMV、CMV和NYSV带毒率分别为38.9%、14.8%和1.85%；组培苗中TMV和CMV带毒率分别为88.9%和11.1%。

水仙；病毒检测；酶联免疫吸附测定

崇明水仙（Narcissus tazetta var.chinensis）为石蒜科水仙属多年生草本植物，是上海唯一地理品牌花卉，与福建的漳州水仙和浙江普陀水仙同属中国水仙的栽培类型。以其浓郁芳香和优美花型驰名中外。然而，影响崇明水仙品质的最大问题是病毒病害，造成种球退化严重，严重影响其观赏价值和推广应用，检测崇明水仙的致病病毒并利用栽培措施加以改善至关重要。

崇明水仙的病害症状主要表现为斑驳、黄条、白条、花叶、叶片扭曲，以及整个植株矮化畸形、鳞茎退化、种球变小、花枝减少、抗性减弱等。国外自1946年开始陆续报道水仙花叶病毒［1］，国内自1985年谢光兀首次报道了中国水仙NMV（水仙花叶病毒）研究［2］，国内外目前已先后报道了近30种侵染水仙的病毒［3］，其中包括烟草花叶病毒属的烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、黄瓜花叶病毒属的黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、香石竹潜隐病毒属的水仙潜隐病毒（Narcissus latent virus，NLV）、马铃薯X病毒属的水仙花叶病毒（Narcissus mosaic virus，NMV）、马铃薯Y病毒属的水仙黄条病毒（Narcissus yellow stripe virus，NYSV）等。通过茎尖培养脱毒、热处理结台茎尖培养脱毒、愈伤组织培养脱毒、原生质体培养脱毒、繁殖组织培养脱毒和茎尖微体嫁接脱毒是目前植物组培的脱毒方法［4］。DHT结合高温处理的崇明水仙脱毒方法DHT 30 mg/L+病毒唑30 mg/L处理能使NMAV含量降低到极微弱的水平，且不影响试管球存活；DHT 10 mg/L+病毒唑10 mg/L处理可以完全脱除NDV和NCLV病毒［5］。进行病毒检测，将有助于种植者对崇明水仙的管理。梁艳等［6］在36个水仙样本上检测到水仙普通潜隐病毒（NCLV）水仙退化病毒（NDV）；此外，有两类分离物被初步鉴定为新病毒，暂命名为水仙斑驳相关病毒（NMaV）和水仙白条相关病毒（NWSaV），其中NMaV为危害水仙的优势病毒。本研究对以上5种病原病毒进行检测。

1 材料与方法

1．1 试验材料

在崇明水仙病毒病调查中，取到褪绿、斑驳、花叶、黄条的田间及组培可疑病株，为明确其病原，并为病毒检疫、病害控制、脱毒提供科学依据。

试验用水仙于2012年4月及12月分别在上海崇明百叶水仙花合作社种植基地及上海园林科学研究所实验室内采集，样本共63份，其中大田实生苗样本54份，组培苗样本9份，其中53份样本明显出现褪绿、斑驳、花叶、黄条等典型病毒症状，另11份为隐症水仙样本（表1）。

表1 病株样本的来源Table 1 Sources of diseased plant samples

1．2 主要试剂

TMV、CMV、NLV、NMV和NYSV 5种病毒的抗血清、酶标二抗、阳性质控、病毒质控及96孔酶标板，购自英国安德珍生物技术有限公司（ADGEN Biotechnology Limited）；硝基苯磷酸酯钠盐（PNPP），购自Sigma公司；其它试剂均为国药公司分析纯。

1．3 双抗体夹心酶联免疫吸附测定法（DAS-ELISA）

取每个样本1 g叶片，以样品和提取液10 mL∶1 g的比例加10 mL提取缓冲液，充分研磨。3 000 r/min离心10 min，留上清液作为抗原。按照试剂盒要求制备阳性质控样品，提取缓冲液做阴性对照。分别移取所有样本、阳性对照和阴性对照，一式2份，各100 μL，37℃孵育30 min。PBST缓冲液清洗酶标板并充满微孔，放置3 min后倒弃，重复3次。加入100 μL稀释后的探针抗体——一抗血清，多克隆兔抗血清，37℃孵育30 min。PBST缓冲液清洗酶标板并充满微孔，放置3 min后倒弃，重复3次。加入100 μL酶标结合物——酶标二抗，碱性磷酸酶标记的山羊抗兔血清，37℃孵育30 min。PBST缓冲液清洗酶标板并充满微孔，放置3 min后倒弃，重复6次，擦干；每孔加入100 μL硝基苯磷酸酯钠盐（PNPP）底物溶液，37℃放置1—2 h。将显色后的酶标板置于酶标仪中，405 nm条件下读数。

2 结果与分析

2．1 DAS-ELISA检测

2012年5月，对采集的63份崇明水仙样本进行DAS-ELISA测定，检出带病样本32份，带毒率共计50.8%，复合感染样本7份，复合感染带毒率11.1%。其中感染TMV样本29份，感染CMV样本9份，感染NYSV样本1份，TMV、CVM、NYSV带毒率分别为46.0%、14.3%、1.6%；复合感染TMV和CMV样本6份，复合感染TMV和NYSV样本1份；均未检出感染NLV和NMV的样本（表2）。

表2 DAS-ELISA测定崇明水仙的带毒率Table 2 Detection of virus-carrying rate of all the tested plants by DAS-ELISA

2．2 大田水仙实生苗DAS-ELISA检测

54份水仙大田实生苗，经DAS-ELISA测定，检出带病样本24份，带毒率共计44.4%。其中感染TMV样本21份，感染CMV样本8份，感染NYSV样本1份，TMV、CVM、NYSV带毒率分别为38.9%、14.8%、1.85%，复合感染TMV和CMV样本6份，复合感染TMV和NYSV样本1份（表3）。

表3 DAS-ELISA测定大田水仙实生苗的带毒率Table 3 Detection of virus-carrying rate of open-cultured plantlets by DAS-ELISA

2．3 水仙组培苗DAS-ELISA检测

9份水仙组培苗，经DAS-ELISA测定，检出带病样本8份，全部感染TMV，带毒率共计88.9%，其中一份复合感染TMV和CMV，CMV带毒率11.1%（表4）。

表4 DAS-ELISA测定水仙组培苗的带毒率Table 4 Detection of virus-carrying rate of tissue-cultured plantlets by DAS-ELISA

3 结论与讨论

根据新西兰的4个水仙品种（‘Carlton’，‘Fortune’，‘Ice Follies’，‘Soleild Or’）试验可以看出，低病毒球茎提供优越产率，并可至少维持两年。脱毒技术使水仙种球提纯复壮，是崇明水仙走出困境的行之有效的方法［7］。2012年，在上海崇明水仙病毒病调查中，进行的TMV、CMV、NLV、NMV及NYSV 5种病毒的检测，结果表明TMV、CMV为侵染崇明水仙的主要病毒。TMV、CMV两者都为RNA病毒，其中TMV能在多种植物上越冬，通过汁液摩擦能侵染大麦、小麦、本明烟、苋色藜，也可通过嫁接传播［8-9］，叶片轻微摩擦造成微伤口，病毒即可侵入，植株染病后出现花叶症状，生长陷于不良状态，叶常呈畸形；CMV主要在多年生宿根植物上越冬，主要由蚜虫以非持久性方式进行传播，专化性较低，目前认为CMV可以由80多种蚜虫传播［10-12］，植株染病后叶枯黄，小且皱缩，呈现花叶状。据报道，在危害中国水仙的病毒种类中，以水仙花叶病毒（NMV）和水仙黄条病毒（NYSV）最为普遍［13］，两者粒子均呈线状［14］。因此，在崇明地区，当下迫切需要采取有效措施防止TMV、CMV的持续蔓延。但是，此次在受检的崇明水仙样本中未检测到NMV，目前崇明水仙上共有4种病毒，分别是已报道的水仙普通潜隐病毒（NCLV）、水仙退化病毒（NDV）和两种未报道的新病毒分离物NMaV、NWSaV，其中NMaV为危害上海崇明水仙的优势病毒，田间多数情况下与NCLV、NDV等病毒复合侵染［6］。上海崇明水仙病毒病病原种类鉴定的报道相一致，NYSV仅在大田实生苗中检测到1份，表明当前这两种病毒在上海崇明水仙上仍可能不是主要的病毒种类。然而，水仙病毒感染植株的速度非常快，在栽培漳州水仙1个月后就可出现病毒病的症状，三个月后可达100%［15］。NYSV能通过汁液传播，也能通过蚜虫非持久性传播，对水仙的经济价值影响很大，崇明水仙感病后表现出花叶、黄条、花瓣开裂和鳞茎矮小等症状［16］。虽然目前仅检测出1份样本感染NYSV，但也需引起重视，加强防疫，避免广泛传播感染。崇明水仙为同源三倍体，具高度不孕性，虽然子房膨大，但种子空瘪，只能以鳞茎作分球繁殖。由于长期的无性繁殖，植物病毒在球茎中的大量积累，造成产量逐年萎缩，种性退化，失去观赏价值和商品性。此次崇明水仙未经脱毒的组培苗病毒检测中，TMV感染率88. 9%，其中1份样品复合感染TMV和CMV，1份样品在5种病毒检测中均呈阴性，这为崇明水仙的组培脱毒筛选培养提供了依据，也为下一步脱毒工作奠定了基础。

上海崇明水仙大田实生苗病毒检测中，出现了病毒复合侵染的情况。病毒复合侵染，会致使单种病毒难于被纯化出来，从而使得一些传统鉴定方法效果不佳，例如症状观察、鉴别寄主反应等。相比传统的病毒检测方法，血清学ELISA灵敏度高，需要的样本材料少，特异性强，并且安全、快速、易观察结果，与RT-PCR等现代分子手段相结合，进行检测、鉴定将更加准确。

在此次病毒检测中，有少部分具有明显症状的样本，未检测出感染TMV、CMV、NLV、NMV及NYSV 5种病毒。由于病毒检测选定在以上5种类型，相对比较局限，在一定程度上可能会影响鉴定的准确性。因此，需要采用更为精准的检测方法进行病毒病病原种鉴定，最终确定这5种病毒病之外的病毒感染类型，为上海崇明水仙的将来打下更坚实的根基。

［1］SLOGTEREN E V，OUTOTER D E.Investigation on virus diseases ofnarcissus［J］.Daffodil Tulit Yb，1964，12：3-20.

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［3］LIN H X，LIN Q Y，XIE L H.Progresson the disease of narcissus viruses（in Chinese）［J］.Plant Quarantine，1996，4（10）：227-229.

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［5］杨柳燕.崇明水仙试管成球及离体脱毒技术研究［D］.南京：南京林业大学，2008.

［6］梁艳，宋荣浩，杨翠云，等.上海崇明水仙病毒病病原种类鉴定［J］.植物病理学报，2008，38（5）：456-461.

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［9］方宇澄.中国烟草病虫害彩色图志［M］.合肥：安徽科学技术出版社，1992.

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［16］CALDWELL K，KISSICK H.Some new virus diseases of ornamental plants［J］.J R Hort Soc，1950，75（9）：350-353.

（责任编辑：程智强）

Double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbant assay of 5 species of viruses in Chinese narcissus in Chongming，Shanghai

BIAN Li-xia
（Forestry Station of Chongming County，Shanghai 202150，China）

With detoxified test-tube plantlets of Chinese narcissus as CK，the open-cultured plants having such leaf symptoms as chlorisis，mottle，mosaic and yellow stripe were used as test materials，5 viral diseases—Tobacco mosaic virus（TMV），Cucumber mosaic virus（CMV），Narcissus latent virus（NLV），Narcissus mosaic virus（NMV），Narcissus yellow stripe virus（NYSV）—were quantitatively detected by double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbant assay（DAS-ELISA）.The results showed that the virus-carrying rate of all the tested plants was 50.8%，and the compound infection rate was 11.1%；In the 54 open-cultured plant samples the rates of carrying TMV，CMV and NYSV were 38.9%，14.8%，and 1.85%respectively，and in the tissuecultured plantlets the rates of carrying TMV and CMV were 88.9%and 11.1%respectively.

Chinese narcissus；Virus detection；ELISA

S436.8；S682.2

A

1000-3924（2016）06-033-04

2015-11-03

上海市科技资助项目（13391912502）

卞黎霞（1978—），女，学士，工程师，主要从事植物保护及花卉、林果栽培。Tel：18918775072，E-mail：cmlinye＠163.com