牛磺酸锌对慢性染汞大鼠皮层CCK阳性神经元的影响

王 衍，陈 玲，金玉忠

沧州医学高等专科学校，河北 沧州 061001

牛磺酸锌对慢性染汞大鼠皮层CCK阳性神经元的影响

王 衍，陈 玲，金玉忠

沧州医学高等专科学校，河北 沧州 061001

〔目的〕 观察牛黄酸锌(TZC)对染汞大鼠皮层内胆囊收缩素(CCK)阳性神经元和学习记忆的影响。〔方法〕 选用健康成年雄性大鼠，共32只，每组8只，共4组。对照组(单蒸水，普通饲料)、染汞组(每天饮用4.3 mg/kg氯化汞水，普通饲料)、汞(每天饮用4.3 mg/kg氯化汞水)+低牛磺酸锌组(饮用含0.23 g/L 牛磺酸锌水，普通饲料)、汞(每天饮用4.3 mg/kg氯化汞水)+高牛磺酸锌组(饮用含0.46 g/L牛磺酸锌水，普通饲料)，各组1 mon后进行实验。采用Y迷宫方法观察各组大鼠在学习记忆方面的差异；采用胆囊收缩素抗体免疫组化方法，观察饮用含4.3 mg/kg氯化汞水和含不同剂量(0.23 g/L, 0.46 g/L) 牛磺酸锌饮水的大鼠皮层胆囊收缩素阳性神经元的变化。〔结果〕 染汞大鼠较对照组大鼠学习记忆能力明显降低，差异有显著性(P<0.05)；汞+牛磺酸锌组大鼠的学习记忆能力较单纯染汞组有明显升高，差异有显著性(P<0.05)；汞+高牛磺酸锌组大鼠较汞+低牛磺酸锌组大鼠表现出更好的保护作用。染汞组大鼠皮层胆囊收缩素阳性神经元的数量较对照组明显减少，差异有显著性(P<0.05)；汞+低浓度牛磺酸锌组大鼠与汞+高浓度牛磺酸锌组大鼠皮层胆囊收缩素阳性神经元较染汞组明显增多但仍低于对照组，差异有显著性(P<0.05)；汞+高浓度牛磺酸锌组大鼠较汞+低浓度牛磺酸锌组大鼠皮层胆囊收缩素阳性神经元数明显增多，差异有显著性(P<0.05)。〔结论〕染汞后大鼠皮层胆囊收缩素阳性神经元表达减少，应用牛黄酸锌对染汞后大鼠皮层胆囊收缩素神经元有明显的保护作用，而且与牛磺酸锌的剂量密切相关。

牛磺酸锌； 汞；胆囊收缩素；神经元

汞作用于中枢神经系统，会造成人或动物学习记忆能力的减退[1]。胆囊收缩素(CCK)是一种与学习记忆功能密切相关的神经肽，主要分布于皮质和海马结构[2]。我们通过观察对照组大鼠、染汞组大鼠、汞+低剂量牛磺酸锌(TZC)组大鼠、汞+高剂量牛磺酸锌(TZC)组大鼠在迷宫实验中的行为学表现和脑组织切片中胆囊收缩素神经元计数的变化，来研究不同剂量牛磺酸锌对染汞大鼠学习记忆能力的保护作用以及汞影响学习记忆的可能机制。

1 材料与方法

1.1 分组及实验动物的准备

选用天津市实验动物中心提供的健康成年雄性大鼠32只，每组8只，共分为4组。对照组，饲单蒸水；染汞组，饲含0.6 g/L氯化汞溶液后饲单蒸水；低剂量牛磺酸锌组，饲含0.6 g/L氯化汞溶液后饲0.23 g/L牛磺酸锌溶液；高剂量牛磺酸锌组，饲含0.6 g/L HgCl2溶液后饲0.46 g/L牛磺酸锌溶液。除对照组外，其他3组每天汞摄入量控制在4.3 mg/kg以下，饲料均为普通饲料。喂养1 mon后各组大鼠同时实验。

1.2 迷宫实验

采用张家港市生物医学仪器厂生产的MG3型三臂迷宫进行测试。迷宫的每个臂内，光、电刺激不同时出现，且保持三臂中两臂有电刺激、一臂有光刺激。将大鼠放入光刺激臂内适应60 s，切换光刺激臂。待大鼠进入光刺激臂后计时，每隔30 min随机切换光刺激臂，共切换20 次/d。最后一次切换后，待大鼠进入光刺激臂并适应30 min后将大鼠取出。每只大鼠连续9次直接从电刺激臂进入光刺激臂为学会，直至所有大鼠学会，实验停止。记录大鼠学会前训练的次数，通过绘制散点图，对数据进行统计学分析。

1.3 胆囊收缩素组化实验

1.3.1 实验试剂 Vector公司生产的1∶2 000胆囊收缩素抗体，上海溶剂厂生产的多聚甲醛，Vector公司生产的1∶100 ABC液等。

1.3.2 取材和切片 用质量分数为0.4%的戊巴比妥钠对实验大鼠进行腹腔麻醉；显露心脏，自心尖将灌注针插人左心室，开放右心耳以便灌注液排出；将生理盐水100～150 mL自左心室快速注入，之后注入体积分数4%的多聚甲醛(4 ℃)500 mL，30～40 min内完成；迅速取出实验大鼠脑组织，用体积分数为4%的多聚甲醛(4 ℃)固定6～9 h后将脑组织依次置于体积分数为10%、 20%、30%的蔗糖溶液中各3～4 h；取右侧脑皮层置恒冷箱冰冻切片机内切片(片厚约50 μm)，用pH 7.4的0.01 mol/L PBS液接片。

1.4 统计学处理

采用单因素方差分析及两两比较LSD检验，用SPSS 11. 0软件处理数据。

2 结果

2.1 迷宫实验

相比于对照组，各染汞组大鼠学会之前的训练次数明显增高，差异有显著性(P<0.05)； 与染汞组比较，在迷宫实验中学会前的训练次数都明显减少，其中高牛磺酸锌组更加明显，P<0.05。见表1。

表1 各组实验大鼠迷宫实验学会次数比较±s)

2.2 免疫组化染色结果

与对照组相比，各组染汞大鼠皮层胆囊收缩素阳性神经元数均明显减少，差异有显著性(P<0.05)。汞+低浓度牛磺酸锌组大鼠与汞+高浓度牛磺酸锌组大鼠，皮层胆囊收缩素阳性神经元数较染汞组明显增多(P<0.05)，但仍低于对照组，差异有显著性(P<0.05)。汞+高浓度牛磺酸锌组大鼠较汞+低浓度牛磺酸锌组大鼠，皮层胆囊收缩素阳性神经元数明显增多，差异有显著性，P<0.05。见表2。

表2 各组大鼠皮层CCK阳性神经元数量测定结果±s)

3 讨论

胆囊收缩素是一种与学习记忆功能密切相关的神经肽，参与内脏调节和感觉传导，且具有较强的兴奋作用，在脑组织中主要以硫酸化的八肽胆囊收缩素形式存在。有实验证实[3]，给实验动物注射胆囊收缩素后，可明显提高实验动物的学习记忆能力；注射胆囊收缩素抗血清后，实验动物的学习记忆能力明显下降。研究证实[4]，胆囊收缩素可以增加实验动物皮层细胞和海马星型胶质细胞内钙离子的浓度。由此推断，胆囊收缩素可能通过增高实验动物细胞内钙离子的浓度，进而激活一氧化氮合酶，升高脑组织一氧化氮水平，最终达到促进学习记忆的效果。

汞是唯一的一种液态金属，其化合物分为有机汞和无机汞两类，对中枢及周围神经系统都会造成损伤。汞对中枢神经系统的损伤主要表现在精神行为控制能力下降、学习记忆能力下降等方面。其作用机理可概括为：一是氧化应激作用；二是导致星型胶质细胞数量变化；三是影响神经细胞内钙离子的平衡；四是阻碍神经递质的正常生理功能等。

牛磺酸是从牛胆汁中分离得到的一种含硫的氨基酸，主要分布于组织细胞中，具有多种生理功能，在免疫系统、消化系统、生殖系统及神经系统维持生理功能方面发挥重要调节作用。锌是人体必需的微量元素，含量及摄入量很少，主要分布在肝脏、肌肉和骨骼中，对机体的生殖发育、脑组织发育及认知能力的形成具有重要作用，而且体内多种酶类需要锌的参与才能发挥作用，缺锌会导致机体免疫力下降及神经组织损伤。牛磺酸锌作为锌与牛磺酸形成的络合物，可以有效防止锌在通过消化道时形成不溶性的化合物或被不溶性的胶体吸附，还可以防止氧化及其他金属元素对行的拮抗作用，牛磺酸锌在消化道内可以以氨基酸的形式被吸收而不依赖于载体，具有更好的生物利用度，在对机体学习记忆能力的保护方面能够起到更好的作用。

本研究结果显示，染汞大鼠皮层胆囊收缩素阳性神经元的数目较对照组减少，差异有显著性。推断，可能是由于汞离子进入机体后，导致脂质过氧化，损伤DNA分子，大量消耗体内活性巯基，机体清除自由基的能力下降，造成对机体的损伤。谷胱甘肽抗氧化物酶系统在保护氧化损伤方面具有重要作用。汞离子进入机体后，大量消耗还原型谷胱甘肽，造成线粒体及细胞内大量活性氧聚积，导致细胞死亡信号传导系统被激活，抑制谷胱甘肽过氧化物酶等抗过氧化物酶的活性，使机体清除自由基的能力下降，同时又产生大量自由基，进一步增强脂质过氧化反应。另外，汞离子还可通过打破钙离子的平衡，使细胞内钙离子聚积，进而激活核酸内切酶、破坏DNA双链结构，还可使细胞凋亡基因大量表达，从而导致细胞凋亡，引起染汞组大鼠皮层胆囊收缩素阳性神经元数目较对照组减少。

本实验证实，染汞组大鼠相比于对照组，其迷宫实验在学会前所用的训练次数明显增加，说明汞确实对实验大鼠的学习记忆能力产生了明显的抑制作用，与此相对应，在观察染汞组大鼠的脑组织切片时发现，其皮层内胆囊收缩素阳性神经元的数量较对照组明显减少，进一步验证了汞损伤大鼠学习记忆能力的推断。

本研究显示，汞+低浓度牛磺酸锌组大鼠与汞+高浓度牛磺酸锌组大鼠皮层胆囊收缩素阳性神经元数较汞组明显增多(P<0.05)，说明牛磺酸锌对大鼠皮层胆囊收缩素神经元有明显的保护作用。生物体内，汞离子的作用是保护生物膜、保护细胞膜、清除自由基、防止自由基损伤等，汞离子相对于锌离子具有更强的组织亲和力，对锌离子具有竞争性抑制作用，所以，当汞离子进入体内后，体内锌稳态被打破，造成体内锌水平下降，导致需要锌离子参与的某些生化反应的酶类活性降低，如超氧化物歧化酶等，实验大鼠摄入汞离子后，这种竞争性抑制得到一定程度的缓解，而且锌是超氧化物歧化酶的重要组成，后者参与机体的抗脂质氧化作用。另外，锌能够使谷氨酸诱导细胞凋亡基因的作用得到抑制，从而降低汞对机体的损伤。牛磺酸(Tau)在中枢神经系统中含量较高，具有抗氧化、保护细胞膜等多种生理功能。研究显示[5]，牛磺酸对神经细胞内钙离子浓度具有双向调节作用，防止细胞内钙超载，能明显提高神经元的存活率，促进神经系统生长发育、增殖分化，增强大鼠学习记忆的作用。Tau还有作为抗氧化剂和细胞调节因子参与保护神经元的作用[6-8]。 牛磺酸对细胞膜的保护作用和对钙离子稳态的调解作用还可以抑制汞离子对血脑屏障的破坏。

本实验饲喂的锌是与牛磺酸配位的有机锌，更易于被吸收，推断其机制可能为：一是牛磺酸根起到了小分子配体的作用，有效防止了络合锌的形成；二是牛磺酸根激活消化道细胞膜上的锌离子载体，加速锌的吸收；三是牛磺酸激活细胞膜上的钠钾泵，造成产能增加，锌的吸收加快。因此，当锌与牛磺酸合用时能够对实验动物的神经细胞起到更好的保护作用。

本研究还显示，汞+高浓度牛磺酸锌组大鼠较汞+低浓度牛磺酸锌组大鼠皮层胆囊收缩素阳性神经元数明显增多，差异有显著性(P<0.05)，提示牛磺酸锌对大鼠皮层胆囊收缩素神经元数的保护作用与牛磺酸锌的剂量密切相关。但有研究显示[9-10]，补锌量低或高其保护作用都达不到最佳效果，有关牛磺酸锌对神经系统发挥保护作用的最佳剂量的确定还有待进一步研究。

[1] Kovacs G, Dewied P. Peptidexgic modulation of learning and memory processses [J]. Pharmacol Rev,2004,46(3):269-291.

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[10] 石磊，糜志远，张迎庆，等. 牛磺酸锌的研究进展[J]. 广州化工，2012,40(7)：57-59.

[责任编辑 时 红]

Effects of Taurine Zinc Coordination Compound on CCK-neure in cortex of Chronicity Mercury Exposed Rats

WANG Yan， CHEN Ling， JIN Yuzhong

Cangzhou Medical College, Cangzhou 061001, China

〔Objective〕To investigate the effects of taurine zinc coordination compound(TZC) on learning memory ability and CCK-neure in cortex of chronicity mercury exposed rats.〔Methods〕32 healthy male rats were choose and divided into four groups trabantly. And the period of the experiment is one month. The differences of learning memory ability were observed using the Y maze test. Rats were used as experimental animals. The effect of CCK neure in cortex were observed using antibody mediated immunity and histological chemistrygroups were fed with 4.3 mg/kg/d. HgCl2and TZC by drinking，and with different dosage of TZC(0.23 g/L or 0.46 g/L) in feed. 〔Results〕Compared with the control group, the time of Y maze test of mercury exposed rats was significantly increased(P<0.05).The learning memory ability of mercury exposed rats were improved after fed with different dosage of TZC, among them Higher dosage of TZC of significantly value(P<0.05). The quantum of CCK-neure in cortex of mercury exposed rats was significantly decreased (P<0.05). The quantum of CCK-neure in cortex was significantly increased after fed with TZC. among them Higher dosage of TZC of significantly value(P<0.05).〔Conclusion〕TZC could evidently improve the quantum of CCK-neure in cortex and the learning memory ability of mercury exposed rats .TZC has significant antagonism on damage of the nervous system induced by mercury.

TZC； Mercury； CCK; neure

1672-7606(2016)04-0256-04

2016-10-10

武警总部科研基金项目(WK2003-12)

王衍(1976-)，男，辽宁海城人,主治医师，从事基础医学教学工作。

R363.1

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